胚胎干细胞(Embryionic stem cell,ES细胞)在自然状态下并不存在,通常从囊胚内细胞团(ICM)分离得到,与ICM细胞一样ES细胞具有暂时性的自我更新和多种分化潜能的性质。ES细胞是具有分化为外胚层、中胚层和内胚层组织细胞能力的干细胞,是研究细胞“干性”和早期胚胎发育的良好模型,因此广泛地应用于发育生物学、细胞生物学、分子生物学和医学等研究领域。ES细胞被认为是细胞组织移植治疗最有潜能的细胞资源。但是传统分离ES细胞的方法引发了伦理方面的问题。最近报道表明可以从着床前小鼠胚胎单卵裂球成功建立ES细胞系,这一突破性进展在一定程度上解决了自体ES细胞临床应用面临的伦理冲突。因此,人们对采用单卵裂球分离自身ES细胞的方法产生了浓厚的兴趣。但是,该方法尚不成熟仍然存在很多问题,如单卵裂球建立ES细胞的成功率相对很低;姐妹卵裂球是否都具有相同的衍生成ES细胞的能力;它们是否有不同的发育命运等等。因此,对单裂球分离ES细胞系进行更为深入的研究,建立适合的培养体系,提高ES细胞的分离效率,对ES细胞临床应用至关重要。本研究以小鼠为模型,深入研究单个卵裂球建立小鼠ES细胞系,优化了培养体系。研究中首先利用MTT法对丝裂霉素C处理后MEF活力变化进行检测。结果显示,第1,3,5代的MEF,丝裂霉素C(10μg/mL)处理2或3hr,其形态良好,活力可稳定维持是制备饲养层较为理想的条件。在MEF共培养体系下,比较了KSOM和mES两种培养液对ES细胞建立的影响,表明KSOM+mES连续培养体系更有利于ICM的形成,且不改变Cdx2阳性细胞(TE)和Sox-2阳性细胞(ICM)之间比率。MEF共培养下采用KSOM及mES连续培养方案,共建立了71个可传至5代以上的ES样细胞系。其中2CBD获得29个ES样细胞系(72.5%),4CBD和8CBD建系率较低分别为30.0%和11.3%。胚胎的发育阶段越高级从单卵裂球建立ES细胞系的成功率越低。此外,本研究通过对干细胞标志分子表达方式和ICM的形成以及ES细胞分离等方面的研究,证明2-细胞,4-细胞和8-细胞胚胎的姐妹卵裂球并不均一,具有不同的发育能力。由于早期胚胎中的分化决定导致了姐妹卵裂球之间多能性的不平等,很可能是导致胚胎单卵裂球建立ES细胞效率较低的原因。此外,本研究中采用MEF共培养体系,大胆比较LIF添加与否对单卵裂球建立ES细胞系的影响。结果表明不论LIF添加与否,2CBD,4CBD和8CBD都可以形成初级扩展生长。尽管胚胎发育率相似,2CBD-LIF和2CBD-control组分别以83.8%和70.0%的比例建立初级扩展生长。可见,饲养层细胞的存在对ES细胞的建立和维持比培养液中添加LIF更为重要。在MEF共培养体系中LIF的添加与否对于建立ES样细胞克隆不是必要条件,而且ES细胞可在不添加LIF的共培养体系中维持自我更新。有趣的是LIF和MEK1/2抑制剂PD98059协作有助于ES细胞的自我更新,在LIF作用下,激活gp130,同时抑制MEK/ERK通路,对于维持ES细胞的自我更新和分化之间的平衡具有重要作用,只有二者之间保持精确的平衡,ES细胞的自我更新才能保证。研究结果表明,PD98059的靶基因ERK1/2可能参与2-细胞阶段母源基因向胚胎基因的转换(MET)并且激活合子基因组。经ES细胞鉴定,结果表明大部分ES样细胞系保持正常的核型并表达多能性的标志分子,可以在嵌合体小鼠中进行生殖系传递。因此从早期胚胎单个卵裂球建立ES细胞系是可行的。随机抽取早期胚胎的单卵裂球,不经任何特殊处理就具有建立ES细胞的潜能。单卵裂球建立ES细胞的成功率与胚胎发育阶段负相关。