杂种优势的利用是提高油菜产量的重要手段,细胞质雄性不育作为理想的授粉控制系统之一,为油菜增产作出了巨大的贡献。油菜CMS类型比较多,根据其细胞质来源可分为两大类：一类是在自然繁殖和进化过程中,由于突变或品种间杂交产生的CMS；另一类是通过种属间远缘杂交或原生质体融合,由核置换或线粒体基因重组而产生的CMS。体细胞杂交可实现两亲本间线粒体基因组的重组,是创制新型雄性不育细胞质的最有效方法之一。我们实验室前期通过电融合的方法获得了白芥(Sinapis alba)和甘蓝型油菜(Brassica napu)体细胞杂种。杂种和甘蓝型油菜品种‘扬油6号’连续回交,在BC3中获得1株育性较为彻底的不育株(染色体数为2n=38),并用不同甘蓝型油菜品种进行测交,筛选获得保持系SaNa-1B,利用该保持系连续回交,选育出稳定的不育系SaNa-1A。(1)通过对不育系和保持系花器官形态学的观察发现,二者在花器官形态上存在较明显的差异,主要表现在不育系雄性生殖器官花药短小、干瘪,表面无明显的花粉附着现象,花瓣皱褶,其它器官与保持系无显著差异。(2)通过对不育系和保持系花药发育不同时期的半薄切片观察发现,与正常的花药发育过程相比,不育系除少部分花药不能形成花粉囊以外,大部分花药能够在发育早期分化形成蝶状的花粉囊。花粉母细胞时期花药中各类细胞的形态结构和保持系无明显的差别。四分体时期,不育系四分体结构外包裹着较厚的胼胝质,绒毡层液泡化严重。单核早期,不育系小孢子细胞内含物较少,液泡化严重,绒毡层浓染,并与花药中层细胞逐渐分离。单核晚期,小孢子彼此粘连在一起形成团状结构,外周被未发生降解的绒毡层细胞紧紧包裹着,并将其挤向药室中央。之后,绒毡层和小孢子团一起逐渐降解退化,最终导致无成熟花粉粒的形成。以上结果说明,不育系SaNa-1A的花药在四分体时期就出现异常,小孢子的发育止步于单核时期。不育系败育的主要原因可能是由于绒毡层的正常降解出现障碍,不能及时的向小孢子的发育提供必需的营养物质所致。(3)我们对不育系和保持系花药发育不同时期又进行了超微结构比较。结果显示,从花粉母细胞时期开始,不育系花粉母细胞的细胞结构就出现异常,如花粉母细胞的体积明显较小,细胞核、核仁也要小于保持系,细胞中出现了许多液泡,部分内质网发生断裂,线粒体结构发生异常。不育系绒毡层细胞的核仁也明显小于保持系。四分体时期,有一些花粉母细胞仍在进行减数分裂,部分四分体内的小孢子液泡化严重,细胞核、核膜等逐渐降解消失,线粒体、内质网等细胞器遭到破坏,四分体结构外周被厚厚的胼胝质包围。此时期的绒毡层细胞出现了体积较大的液泡,且并未发生正常的降解,无法大量的分泌胼胝质酶,直至单核时期,绒毡层才开始出现降解的迹象,并出现包含着孢粉素等物质的绒毡层小体等。单核期,小孢子外周虽然有孢粉素的沉积,但是细胞内的线粒体等细胞器、细胞核都已消失降解,就剩下体积较大的液泡,至单核晚期,小孢子的细胞内含物全部降解,无任何物质,最后与绒毡层一起降解退化。以上结果说明,不育系花粉母细胞的发育一开始就已显现出缺陷,而绒毡层细胞降解的延迟和发育的不正常,又进一步抑制了小孢子的发育,最终导致败育。(4)通过对不育系和保持系不同发育时期的花药及其线粒体的生理生化指标分析发现,不育系败育前,其离体线粒体中的ROS含量就高于保持系,败育现象出现后,ROS的积累显著升高,且远大于保持系。对负责清除ROS的抗氧化酶系统的酶活性分析显示,不育系花药中的SOD活性随着败育的出现先升高后降低,但各时期的SOD活性均显著低于保持系,而POD活性却出现显著提高,且高于保持系。这些结果说明,不育系败育出现后,ROS的大量积累诱导了SOD、POD这些抗氧化酶系统的应答,但显然一方面SOD的活性受到了抑制,降低了清除ROS的效率。而另一方面,由于POD是一种具有多重功效的酶,它既能有效清除氧自由基,也能对植物生长素的合成产生抑制效应,所以不育系花药中POD活性的提升既是不育系应对ROS积累的应答,但同时也可能对花药的生长发育产生一定的负面作用。同时,不育系中过量的ROS积累以及抗氧化酶系统的缺陷又进一步使膜脂发生过氧化,致使花药中的MDA过量积累,对细胞产生毒害作用。此外,通过对不育系和保持系花药离体线粒体中的F1F0-ATPase活性、ATP含量以及花药COX活性的比较发现,不育系花药离体线粒体中的F1F0-ATPase水解活性随着发育的进行显著降低,且低于保持系,而线粒体中ATP的积累也出现类似的变化。不育系花药中的COX活性也随着败育的发生出现了显著的降低,但单核期又出现一定的升高趋势。以上结果说明,ROS的积累给不育系花药的发育造成了较大的影响,继而使线粒体膜上的呼吸电子传递链的末端氧化酶的结构和功能发生异常,影响了COX和F1F0-ATPase的活性,从而抑制了ATP的合成。再加之不育系花药中的脯氨酸积累的匮乏,使花药的生长和发育进一步遭受抑制,这些生理机制共同作用,导致了不育系的败育。(5)通过DNA片段化检测实验(TUNEL)研究花药发育过程中出现的PCD事件。结果显示,正常的花药在四分体时期,绒毡层细胞会发生PCD,并在单核期达到峰值,至花粉成熟期杂交信号逐渐开始向外层扩展,为下一步成熟花粉粒的释放做好准备。对于不育系,发现在四分体结构的小孢子中出现了杂交信号,说明此时小孢子已经开始出现PCD现象。而此时期,不育系的绒毡层细胞未出现显著的PCD现象,至单核期才检测到少量PCD的发生。此外,单核期保持系小孢子外周出现的强烈黄绿色的荧光信号,显示出大量孢粉素的沉积,而不育系小孢子外的孢粉素沉积较少。这些结果进一步验证了前面细胞学的研究结果,结合生理生化指标的分析,表明不育系ROS介导的小孢子的PCD以及绒毡层的发育异常,是导致SaNa-1A败育的主要原因。(6)使用高通量测序技术对不育系SaNa-1A和保持系SaNa-1B两个材料花药发育的四分体时期进行了RNA-seq测序,经de novo组装后分析二者的基因表达情况,最终共筛选到了9440个DEGs。对这些DEGs进行进一步的生物信息学分析,发现有18个DEGs与线粒体的TCA循环、电子传递链和氧化磷酸化等功能有关,且大部分基因显著下调表达。尤其是编码ATPase亚基的基因的异常表达可能是造成不育系败育现象的根本原因之一。同时,有14个DEGs与调控花药发育的过程有关,其中除TPD1基因外,其他均在不育系中下调表达。这些核基因的异常表达直接导致了不育系在花药发育过程中呈现出与保持系不同的发育过程。结合前人的研究结果,我们推测出不育系SaNa-1A发生败育的分子机制模型,即：不育系线粒体基因组发生突变,产生了新的开放阅读框,形成嵌合基因,与编码ATPase的某个亚基的基因形成共转录,影响了ATPase的结构,从而使F0F1-ATPase出现功能缺陷,继而又影响线粒体其他基因(如涉及电子传递、氧化磷酸化、TCA循环、糖代谢等过程的基因)的表达,使线粒体的结构和功能发生障碍。并通过信号传导将不育信号传入细胞核内,导致调控花药发育的核基因AG及其下游基因的表达发生改变,最终导致SaNa-1A的败育。此外,我们还发现了12个可能与育性恢复相关的PPR蛋白。对上述这些候选基因表达模式的继续深入研究,可以帮助我们进一步阐明线粒体中的CMS基因对下游基因的调控网络,并对育性恢复基因的寻找提供支持。