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香鳞毛蕨Dryopteris fragrans（L.）schott为鳞毛蕨科鳞毛蕨属植物,近代研究发现香鳞毛蕨对多种由真菌引起的皮肤病具有显著疗效,而且间苯三酚类化合物为鳞毛蕨属植物的主要活性成分。本课题组从该植物中分离出多种间苯三酚类化合物,药理研究表明间苯三酚类化合物具有较强的抗真菌活性,其中绵马酚对常见的皮肤真菌表现出最强的活性。甲基间苯三酚作为绵马酚的中间体,由于其结构的活泼性和取代基的多样性,使得甲基间苯三酚的结构可以衍生出多种结构复杂的化合物;课题组前期研究发现甲基间苯三酚的羟基为化合物活性基团,并且C-4或C-6为活泼位点,在此位置引入不同的基团或可使得化合物性质、生物活性发生改变。因此,本研究首先在甲基间苯三酚结构中引入不同的官能团,得到新的间苯三酚类化合物,然后通过抗菌活性研究结合分子模拟试验和双抗体夹心法试验（ELISA法）,考察引入不同基团后所得化合物抗菌作用及作用机制,为间苯三酚类化合物抗真菌作用及作用机制的研究奠定基础。本次研究主要目的有:（1）以绵马酚中间体甲基间苯三酚为基础,引入丁酰基及特比萘芬起效基团-烯丙氨基,建立甲基间苯三酚衍生物的合成方法、路线。（2）通过抗真菌活性筛选及动态杀菌曲线的研究,考察间苯三酚类化合物抗菌活性及起效时间。（3）基于分子模拟试验及酶活性验证试验,考察甲基间苯三酚衍生物抗真菌作用靶点及作用机制,为进一步阐明间苯三酚类化合物的抑菌作用机制奠定基础。主要研究内容如下:1.间苯三酚衍生物的合成:以间苯三酚为原料,合成间苯三酚甲醛,经过还原反应得到甲基间苯三酚,在经过傅-克反应引入丁酰基及烯丙氨基,最终得到目标化合物,得到的化合物通过MS、1H-NMR、13C-NMR等手段进行结构确证。2.根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）M38-A2方法分别测定各化合物对红色毛癣菌、石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌以及犬小孢子菌的最低抑菌浓度（MIC）及最低杀菌浓度（MFC）,从中筛选出活性最强的化合物及最敏感的真菌。3.采用菌落计数法测定不同浓度的受试化合物对犬小孢子菌的杀菌曲线,考察受试化合物对受试真菌的动态抑制作用。4.采用Discovery Studio2.5.5软件及AMBER9.0软件进行分子对接模拟和分子动力学模拟,通过受试药物与靶点之间对接的-CDOCKER energy以及分子动力学模拟的RMSD值,比较受试药物与靶点之间的结合作用的强弱及结合的稳定性,探讨其可能的抑菌机制。5.采用UPLC法建立麦角甾醇的含量测定方法,考察犬小孢子菌经化合物作用后,麦角甾醇含量的变化。6.采用ELISA法,考察各药物组对羊毛甾醇14α-去甲基酶（CYP51）、角鲨烯环氧化酶（squalene epoxidase）及β-1,3葡聚糖合成酶（glucan synthese）等三种酶活性的影响,进一步探讨化合物抑菌机制。研究结果如下:1.甲基间苯三酚衍生物合成试验结果显示:以间苯三酚为原料,经过Vilsmeier-Haack反应、还原反应,傅-克反应等方法成功合成了甲基间苯三酚,然后对甲基间苯三酚进行结构修饰,结果得到了4种衍生物,即2-甲基-4-丁酰基间苯三酚（产率为28.6%）,2-甲基-4,6-二丁酰基间苯三酚（产率为47.2%）、1-（2-丁烯氨基）-3-甲基-5-丁酰基间苯三酚（产率为35.7%）及一种中间体1-（2-丁烯氨基）-3-甲基间苯三酚（产率为81.2%）;合成工艺优化结果显示,最佳合成工艺为:原料与催化剂的摩尔比例为1:4,加入10倍量的二氯甲烷,在45℃水浴温度下进行反应6 h,在此条件下,目标化合物的产率最高,约为48.7%。通过UPLC测定所得到化合物的纯度,纯度均大于90%,并通过质谱、核磁共振鉴定所得化合物为目标化合物。2.根据美国CLSI制定的M38-A2,采用微量稀释法,对得到的6种间苯三酚衍生物进行活性筛选,结果显示6种化合物对4种常见的皮肤癣菌均有不同程度的抑制作用。对红色毛癣菌的MIC的大小顺序为:1-（2-丁烯氨基）-3-甲基-5-丁酰基间苯三酚（g）>2-甲基-4,6-二丁酰基间苯三酚（e）=间苯三酚甲醛（b）>甲基间苯三酚（c）、2-甲基-4-丁酰基间苯三酚（d）、1-（2-丁烯氨基）-3-甲基间苯三酚（f）。对石膏样孢子菌的MIC的大小顺序为:1-（2-丁烯氨基）-3-甲基-5-丁酰基间苯三酚（g）=2-甲基-4,6-二丁酰基间苯三酚（e）>间苯三酚甲醛（b）>甲基间苯三酚（c）、2-甲基-4-丁酰基间苯三酚（d）、1-（2-丁烯氨基）-3-甲基间苯三酚（f）。对须癣毛癣菌的MIC的大小顺序为:1-（2-丁烯氨基）-3-甲基-5-丁酰基间苯三酚（g）=2-甲基-4,6-二丁酰基间苯三酚（e）>间苯三酚甲醛（b）>甲基间苯三酚（c）、2-甲基-4-丁酰基间苯三酚（d）、1-（2-丁烯氨基）-3-甲基间苯三酚（f）。对犬小孢子菌的MIC的大小顺序为:1-（2-丁烯氨基）-3-甲基-5-丁酰基间苯三酚（g）>2-甲基-4,6-二丁酰基间苯三酚（e）>间苯三酚甲醛（b）>甲基间苯三酚（c）、2-甲基-4-丁酰基间苯三酚（d）、1-（2-丁烯氨基）-3-甲基间苯三酚（f）。3.采用菌落计数法考察2-甲基-4,6-二丁酰基间苯三酚（e）与1-（2-丁烯氨基）-3-甲基-5-丁酰基间苯三酚（g）对犬小孢子菌的时间-杀菌曲线,结果显示,与空白组比较,2-甲基-4,6-二丁酰基间苯三酚（e）与1-（2-丁烯氨基）-3-甲基-5-丁酰基间苯三酚（g）两种衍生物给药浓度为1/2MIC时,药物作用96h后,仍未有效杀死犬小孢子菌;当给药浓度为MIC或2MIC时,犬小孢子菌经药物作用72h后,菌液浓度减少达到99.9%,能完全杀死犬小孢子菌。4.分子模拟实验结果表明,甲基间苯三酚及其衍生物与几丁质酶、甘露糖合成酶不能完成对接;与角鲨烯环氧化酶、羊毛甾醇-14-α-去甲基酶及β-1,3-葡聚糖酶等三种靶酶相结合,并且结合模式相似,均通过苯环与TRP氨基酸基团之间的Π-Π键及化合物分子中的H或者O与氨基酸中的O或者H形成氢键的作用相结合,并且结合的氨基酸类型相似;其中化合物e及化合物g结合作用较强,均大于化合物d,这可能跟化合物e与化合物g中的丁酰基、烯丙氨基等基团有关。分子动力学结果表明,三种化合物对于三种酶动力学模拟在30ns内趋于稳定,RMSD值均保持在1.0-1.5之间,表明了三种化合物与酶受体之间分子对接的合理性及稳定性。5.麦角甾醇含量测定实验结果显示,麦角甾醇在4-40μg/mL范围内线性关系良好,回归方程Y=6287X-361.06,R2=0.9997,精密度、准确度良好,样品在24h内稳定性高;并且与空白组比较,经药物作用后的犬小孢子菌中麦角甾醇的含量显著性降低（P<0.05）。与空白组比较,化合物g给药浓度为1/2MIC、MIC、2MIC时,麦角甾醇含量的下降率为15.76%、34.28%、56.83%;化合物e给药浓度为1/2MIC、MIC、2MIC时,麦角甾醇含量的下降率为13.55%、26.17%、55.59%;盐酸特比萘芬MIC组与硝酸咪康组MIC组使得麦角甾醇含量的下降率为45.37%、49.11%。6.酶联接免疫吸附剂测定（ELISA）结果表明,化合物e与化合物g两种受试化合物对β-1,3-葡聚糖合成酶、羊毛甾醇14α-去甲基酶和角鲨烯环氧化酶等三种酶的活性均不同程度的降低,并且呈现剂量依赖性。综上所述,本研究以甲基间苯三酚为基础,引入丁酰基与烯丙氨基等不同的基团,建立了2-甲基-4-丁酰基间苯三酚,2-甲基-4,6-二丁酰基间苯三酚、1-（2-丁烯氨基）-3-甲基-5-丁酰基间苯三酚及1-（2-丁烯氨基）-3-甲基间苯三酚的合成路线,此路线较伪绵马酚的合成路线简单、反应条件温和,并且所得产物产率较高;其中化合物1-（2-丁烯氨基）-3-甲基间苯三酚与2-甲基-4,6-二丁酰基间苯三酚显示出较强的抗菌作用。抗菌作用机制研究表明,1-（2-丁烯氨基）-3-甲基间苯三酚与2-甲基-4,6-二丁酰基间苯三酚可通过抑制麦角甾醇合成过程中的关键酶角鲨烯环氧化酶和羊毛甾醇-14-α-去甲基酶使得麦角甾醇的合成受阻,使得麦角甾醇的含量降低,最终导致真菌细胞膜破裂,真菌凋亡;除此之外,两种化合物亦可通过影响真菌细胞壁中β-1,3-葡聚糖酶的活性,进而影响真菌细胞壁的主要成分-葡聚糖,导致真菌凋亡。