第一部分HCMV PP65 截短基因的原核表达及PP150原核表达条件的优化 HCMV属疱疹病毒β亚科，人类对其普遍易感。HCMV IgM阳性是近期感染标志。免疫学方法检测HCMV IgM是临床上确诊近期及复发感染最常用的方法。决定免疫学检测方法的敏感性和特异性的关键试剂之一就是HCMV抗原。目前国内试剂盒多采用全病毒抗原，该抗原成分复杂，易受非特异性因素(如混有成纤维细胞成分)的干扰，结果欠准确。 基因工程抗原结构单纯、性质稳定，可以提高免疫反应的敏感性、特异性、稳定性，易于标准化，生物安全性好。目前基因工程抗原已在逐渐代替全病毒抗原。但是，国内基因工程抗原敏感性低，抗原性不稳定，而进口试剂价格昂贵，不利于检测试剂盒的普及应用。 HCMV被膜磷蛋白PP65是病毒主要结构蛋白，编码基因UL83全长1686bp，561aa，有高度的保守性。PP65蛋白的297-510aa、372-445aa、401-426aa和513-539aa都有很高的亲水性，是抗原决定簇，可特异性的诱导IgM产生。 HCMV磷蛋白PPl50编码基因UL32全长3147bp，1048aa。PPl50蛋白的594-623aa、862-1048aa、1006-1048aa与IgM反应最为特异，但敏感性较差，几个肽段联合表达时可提高反应的敏感性。 用蛋白质分析系统软件预测HCMV PP65之321aa-562aa、PPl50之591aa-633aa和C末端1008-1046aa为具有较强抗原性、亲水性及与IgM特异性反应的氨基酸序列。 本课题，设计用原核载体系统表达HCMV PP65之321aa-562aa、PPl50之59laa-633aa和C末端1008-1046aa，为EIASA、胶体金、免疫化学发光、蛋白芯片检测提供抗原性强、敏感性好、特异性高的检测试剂。 方法： 一．HCMV PP65截短基因的原核表达 1．PP65重组克隆载体pMDl 8-T-PP65的构建： 根据PP65氨基酸序列321aa-562aa相应碱基序列961-1686bp(共726bp)设计引物，全病毒基因组作模板，PCR扩增PP65片段，与克隆载体pMD18-T连接，转化TOP10菌株。 2．PP65重组表达载体pET30a(+)-PP65的构建： 筛选含重组克隆载体的菌株扩增，提取质粒DMD18-T-PP65，同时提取质粒pEZ30a(+)，用Nde Ⅰ、XhoⅠ酶切，电泳后回收PP65及pET30a(+)片段，两者进行连接后转化大肠杆菌BL21。 3．PP65工程蛋白的表达： 将含有重组表达载体pET30a(+)-PP65的菌体用诱导剂IPTG进行诱导表达。 4．PP65表达产物的鉴定与蛋白纯化： 用抗-HIS单克隆抗体作为一抗，羊抗人-HRP作为二抗进行westernblot鉴定，用HIS-TAG蛋白纯化柱进行纯化。 5．PP65蛋白抗原性的检测： 与全病毒抗原比较、用ELISA方法对PP65抗原性、敏感性、特异性进行检测。 二．HCMV PPl50原核表达条件的优化 重组表达载体pET30a(+)-PP65，由本室构建。鉴于表达量低，故设计如下优化方案： 1．转换表达系统(由pET30a(+)-PP150-BL21转换为pBAD24-PP150-TOP10) 将保存菌液提取pET30a(+)-PP150质粒为模板，设计引物，PCR扩增目的基因，连接至pMD18-T载体，转化大肠杆菌TOP10。筛选阳性菌株，提取质粒pMD18-T-PP150，同时提取质粒pBAD24，SmaI、HindⅢ酶切，琼脂糖电泳后回收PPl50及pBAD24片段，两者连接后转化TOP10。将阳性菌株用LB培养基扩增，加入终浓度0.2％L-arab诱导表达。 2．转换宿主菌表达(由BL21(DE3)转换为BL21(DE3)plysS) 将本室保存重组表达载体系统pET30a(+)-PP150-BL21(DE3)提取质粒，转化BL21(DE3)plysS，IPTG诱导表达，用抗一HIS单克隆抗体作为一抗，羊抗人-HRP作为二抗进行westemblot鉴定。与全病毒抗原比较、用ELISA方法对PP150抗原性、敏感性、特异性进行检测。 结果： 一．HCMV PP65截短基因的原核表达 PCR方法调取PP65目的基因片段，构建重组克隆载体pMDl8-T-PP65及重组表达载体pET30a(+)-PP65。表达载体转化感受态BL21后用IPTG进行诱导表达，35℃诱导4h目的蛋白表达量约占总菌体蛋白的20％，纯化后蛋白量占未纯化蛋白量的10％。 二．HCMV PPl 50原核表达条件的优化 1．转换表达系统(由pET30a(+)-PP150-BL21转换为pBAD24-PP150-TOP10) 构建重组克隆载体pMD18-T-PP150及表达载体pBAD24-PP150。对重组表达载体转化感受态TOP10后进行0.2％L-arab诱导表达，35℃诱导4h目的蛋白表达量低于菌体蛋白的7％。 2．转换宿主菌表达(由BL21(DE3)转换为BL21(DE3)plysS) 将重组表达载体pET30a，(+)-PP150转化感受态BL21(DE3)plysS，IPTG诱导表达，30℃诱导4h，PPl50目的蛋白表达量约占总菌体蛋白的20％。 三．抗原性检测 初步ELISA检测结果表明，PP65抗原性、敏感性和特异性优于全病毒抗原，PP150抗原性、敏感性及特异性弱于PP65。 结论： 1．构建PP65重组克隆载体pMD18-T-PP65和表达载体pET30a(+)-PP65，表达量占总菌体蛋白的20％，初步检测其抗原性较强、敏感性及特异性高于全病毒蛋白。 2．构建重组克隆载体pMD18-T-PP150和表达载体pBAD24-PP150，转化TOP10菌体，表达量低于总菌体蛋白的7％。 重组表达载体pET30a(+)-PP150转化感受态BL21(DE3)plysS，表达量占总菌体蛋白的20％，初步检测其抗原性、敏感性及特异性弱于PP65。 第二部分 真菌提取物JN219抗病毒谱的初步研究 上世纪发现抗菌抗生素的发现，也为寻找抗病毒抗生素提供了研究途径。本研究就是在获得一株可产生抗病毒活性成分真菌的基础上，进行了抗病毒谱的初步研究。 目的：探讨真菌提取物JN219的体外抗病毒谱。 方法：采用体外细胞病变法，研究JN219对疱疹病毒科病毒(HCMV、HSV-1、HSV-2)、腺病毒科病毒(Ad3)、副粘病毒科病毒(RSV)、呼肠病毒科病毒(RV SA11)、正粘病毒科病毒(流感甲地方株、流感乙地方株)、小RNA病毒科病毒(COX B1-6)、弹状病毒科病毒(VSV)共15株病毒的抗病毒活性。将JN219与以上病毒作用1h后接种于相应宿主细胞(同时设有病毒对照和细胞对照)，当病毒对照病变达到90％以上时终止培养，宿主细胞用1％中性红染色，在450nm读取吸光度A值，．计算细胞存活率、半数中毒浓度(TD<,50>)、半数有效浓度(IC<,50>)和抑毒指数(TI)。并根据TI判断JN219的抗病毒活性，确定其抗病毒谱。 结果：JN219对HCMV、RV(SA11)、VSV有抑制作用，其IC50分别为1.42、0.96和1.22 μg/ml，T1分别为35.26、52.30、40.82；对HSV-1、HSV-2、RSV、流感病毒甲、流感病毒乙有部分抑制作用；对COX B1-6、腺病毒(Ad3)无作用。 结论：JN219抗病毒谱比较广泛。