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苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL,EC 4.3.1.5),主要催化L一苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸,为多种酚类及类黄酮终产物提供前体物质,是连接初级代谢和苯丙烷类次级代谢第一步反应的酶,也是关键酶和限速酶。通过这一途径可以产生多种具有重要生理功能的次生代谢物质,如花色素、木质素、植保素等,这些物质在植物的生长发育、抗病、抗逆反应中起着重要的作用。本研究对大豆PAL基因(GmPAL)进行克隆,并在此基础上利用生物信息学手段对大豆PAL基因家族的两个成员GmPAL1和GmPAL2推导出的蛋白质序列进行主要结构分析和功能预测,主要研究结果如下:1运用PCR扩增技术首次克隆了大豆苯丙氨酸解氨酶基因GmPAL2(GenBank accession number:GQ358921)。测序结果表明,GmPAL2基因组DNA长度为4210bp,含有2个外显子和1个内含子。与此同时克隆了已知的GmPAL1基因组DNA,测序表明其长度为3658bp,和大多数PAL基因一样包含两个外显子和一个内含子。2利用RT-PCR方法成功地从大豆中克隆了已知的苯丙氨酸解氨酶基因GmPAL1mRNA (GenBank accession number:X52953)和未知的GmPAL2 mRNA(GenBank accession number:GQ220305)。获得的GmPAL1cDNA基因长度为2144bp,该基因可编码712个氨基酸,其推导出的氨基酸序列与其它植物PAL基因的具有较高的同源性。获得的GmPAL2cDNA基因长度为2284b,该基因可编码717个氨基酸,而且其推导出的氨基酸序列与其它植物PAL基因的也具有较高的同源性。3用ExPasy软件包和TOPPRED在线分析GmPAL的理化特性,结果表明GmPAL1的理论等电点PI=6.14,蛋白质相对分子量Mw=77.715kDa;GmPAL2的理论等电点PI=5.83,蛋白质相对分子量Mw=78.116kDa。二级结构预测结果显示,GmPAL1的α螺旋在49.09%左右,延伸链在7.11%左右,无规则卷曲在43.79左右;GmPAL2的α螺旋在48.46%左右,延伸链在6.46%左右,无规则卷曲在45.08左右,表明PAL为混合型蛋白。运用MEGA2.0软件构建了GmPAL的系统进化树,GmPAL和豌豆(Pisum sativum)、菜豆(Phaseolus vulgaris)的同源性很近。4运用在线Motiff分析系统,得知推测的PAL1氨基酸序列的194-210区域和PAL2氨基酸序列的199-215区域的GTITASGDLvPLSyiaG为PAL的活性位点,属于植物PAL的特征序列,进一步验证了所得序列均为PAL序列。启动子(promoter)是RNA聚合酶能够识别并与之结合,从而起始基因转录的序列,作为转录水平上一种重要的调控元件,研究启动子,对我们了解生物的生长发育过程,探讨生物对其生长环境的适应机制以及更好地控制外源基因在转基因植物中的表达等具有重要意义。本研究取得的主要结果如下:应用RAIL—PCR技术,克隆获得了大豆PAL1和PAL2的上游启动子区,分别为2509bp和1384bp。对获得的启动子序列进行分析,发现了多个CART-box和TATA-box。TATA框具有将RNA聚合酶II引导到正确的转录起始位点的功能,CART框主要控制着转录的起始频率,是调控转录速率的元件,与启动子的特异性无直接的关系。此外,还发现了多个潜在的顺式作用元件,如与ABA诱导相关的顺式作用元件ABA响应元件(ABRE)、与干旱诱导有关的MYB结合位点(MBS)、与茉莉酸甲酷反应相关的顺式调控元件TGACG-motif,以及多个光响应元件ACE, G-box, GTl—motif,I—box,SpI,另外还发现了在胡萝卜中被认为是PAL1启动子区域核心序列的BOXLCOREDCPAL。