目的：骨髓移植被认为是目前治疗各种血液系统恶性肿瘤，例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等最好的治疗方法，然而，临床上由于没有足够的合适的骨髓捐献供者，化疗仍是该部分患者唯一的治疗选择，不幸的是，临床耐药是成功化疗的主要障碍。在过去30年，一系列多药耐药蛋白，例如ABCB1/P-gp、MRP1-9、ABCG2/BCRP、LRP被鉴定出与耐药有关，其中ABCB1/P-gp，最重要的ABC家族膜蛋白成员之一，由MDR1(multidrugresistance1，MDR1)基因编码，临床发现其与多种肿瘤耐药有关，P-gP作为药物外排泵能够降低细胞内药物累积，因此导致化疗失败。多项研究显示ABCB1/P-gp的高表达与血液系统恶性肿瘤病人预后相关。然而，这种化疗后高表达和功能的改变以及其上调的精确机制目前仍不清楚。MDR1基因突变、易位以及与CD34的联合表达可能导致MDR1基因的内在表达。然而，功能的MDR1基因突变可能不是P-gp功能改变的主要因素。另一方面，化疗药物可引起P-gp的高表达，DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，可能存在于所有高等生物中，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。当细胞癌变时，某些抑癌和DNA修复基因的CpG岛易出现过度甲基化，从而引起基因的沉默；另一方面，过低甲基化导致一些在正常情况下受到抑制的一些基因如癌基因，或相关因子得到大量表达，同时导致整个基因组的不稳定性增加。近来研究发现，MDR1肩动子区甲基化与肿瘤耐药密切相关，这种异常甲基化导致转录因子更易与启动子区结合，从而启动转录，导致P-gp高表达而产生耐药。DNA甲基转移酶抑制剂DAC(5-Aza-cytidine)和组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂一曲古抑菌素TSA联合应用能够抑制细胞的增殖。　　 各种分子生物学变化导致耐药蛋白的上调从而引起化疗耐药，然而，这种变化并不能用来解释为何敏感细胞和耐药细胞混合培养，导致敏感细胞逃避药物细胞毒性最终导致化疗耐药，进而获得多药耐药基因型(Aquired MDR)。几项研究显示，细胞能够通过转移膜蛋白进行通讯，从而导致瞬时转移新的细胞膜蛋白至受体细胞。细胞与细胞之间的通讯在协调控制多元细胞系统中是必须的，多项研究集中在阐明神经元突触细胞间应答(在细胞间建立紧密连接)。最近，细胞间膜蛋白转移研究主要集中在免疫反应细胞。在骨骼系统，研究显示T细胞能够转移膜蛋白片段经过一激活过程，从而改变了T细胞的功能，然而，血液系统中，细胞处于悬浮状态，这使通过转移膜蛋白导致细胞间的交流比实体肿瘤细胞变得相对容易。更为重要的是P-gp是否能够在血液系统细胞间发生转移仍没有人研究。　　 逆转MDR的策略主要集中在抑制或调控P-gp的活性。各种各样的逆转剂相继被研究，有几种已经进入临床试验，不幸的是，没有一个应用于临床。我们先前研究发现几种酪氨酸激酶抑制剂，如lapatinib(Tykerb，GW572016)，erlotinib(Tarceva，OSI-774)，vandetanib(Zactima，ZD6474)，cediranib(recentin，AZD2171)，sunitinib(SUTENT，SU11248)能够调控某种ATP-binding cassette(ABC)转运蛋白的功能，在几种耐药肿瘤细胞中能够逆转ABCB1/P-glycoprotein和/或ABCG2/BCRP介导的多药耐药。Nilotinib和dasatinib，第二代酪氨酸激酶抑制剂，靶点为BCR-ABL蛋白ATP结合位点，对第一代药物imatinib耐药的病人同样有效。然而两种药物对干细胞来源的表达CD34+，CD38-细胞都没有效。几项研究显示，nilotinib不仅对野生型的BCR-ABL有效，其IC50小于30nM，而且对于imatinib耐药的BCR-ABL32/33突变株亦有效。然而nilotinib和dasatinib是否具有以上提到的几种酪氨酸激酶抑制剂类似效果目前没有研究。　　 本研究中，我们调查了228例血液系统恶性肿瘤病人(90例健康对照)的多药耐药基因ABCB1/P-gp、ABCG2/BCRP、ABCC1/MRP1、ABCC4/MRP4的表达，分析了MDR1基因CpG岛甲基化状态与转录活性的关系，分析了MDR1基因启动子低甲基化状态、高表达与临床预后的相关性。进而通过共聚焦和流式细胞分析方法评价了体内外ABCB1/P-gp在耐药细胞K562/A02与敏感细胞K562间的转移，进而用Rh123和阿霉素累积实验和MTT方法评价了转移ABCB1/P-gp蛋白的功能。最后调查了Nilotinib和Dasatinib在临床几种常见的耐药蛋白过表达细胞和CD34+，CD38-病人细胞的逆转作用及机制。　　 方法：荧光定量PCR法检测ABCB1/P-gp，ABCG2/BCRP，ABCC1/MRP1，ABCC4/MRP4的表达。流式细胞法检测细胞膜蛋白的表达及罗丹明123和阿霉素累积。免疫印迹检测蛋白表达。MSP PCR和亚硫酸氢钠基因组测序分析MDR1基因启动子甲基化。荧光素酶报告系统分析相对荧光素酶活性。激光共聚焦分析P-gp细胞间的转移。移植瘤实验分析体内P-gp细胞间转移。细胞毒测定用MTT法；钒敏感法测定Nilotinib对ABCB1ATPase活性的影响。　　 结果：　　 ⑴MDR1 mRNA的高表达与启动子低甲基化高度相关，并且与预后相关，包括未移植病人2年生存率和移植病人完全缓解率。　　 ⑵荧光素酶报告基因分析显示，MDR1基因启动子-50区相对荧光素酶活性甲基化组比未甲基化组高。随着5氮胞苷的处理时间增加，敏感细胞K562中MDR1mRNA表达逐渐上调。　　 ⑶体内外研究显示，ABCB1/P-gp能够从耐药白血病细胞K562/A02转移至邻近敏感细胞。而且，MTT分析和阿霉素累积实验显示，P-gp能够在混合培养裸鼠移植瘤内发生转移，并最终导致重要的耐药基因型。　　 ⑷P-gp细胞间转移依赖于敏感细胞与耐药细胞之间的比例。此外，转移的P-gp能够降低罗丹明123的累积。　　 ⑸Nilotinib能够显著增加ABCB1/P-gp和ABCG2/BCRP过表达细胞和CD34+CD38-的白血病细胞的敏感性，增加其细胞内的药物浓度，对ABCC1/MRP1和ABCC4/MRP4介导的MDR则无明显逆转作用。　　 ⑹Nilotinib不会改变ABCB1和ABCG2 mRNA和蛋白水平的表达。ATPase分析发现，nilotinib能够增加ABCB1/P-gp的活性。　　 ⑺Dasatinib不能增加ABCB1/P-gp，ABCG2/BCRP，ABCC1/MRP1和ABCC4/MRP4P过表达细胞的敏感性，也不能增加其细胞内的药物累积。　　 结论：　　 ①MDR1基因启动子甲基化改变可能是化疗后其mRNA转录水平表达上调的必要条件和重要原因，这种甲基化的异常可能导致启动子区染色质结构改变，影响转录因子SP1和EGF1的结合位点，导致表达上调。　　 ②MDR1基因启动子低甲基化和高表达与病人预后高度相关：MDR1基因甲基化状态与mRNA的表达呈负相关，未移植病人中低甲基化病人完全缓解率低，移植病人中出现高复发率。　　 ③ABCB1/P-gp能够在细胞间发生转移，可能在白血病细胞介导获得性耐药起重要作用。　　 ④ABCB1/P-gp细胞间转移可能对保护敏感细胞逃避药物细胞毒性，在化疗过程中获得一持续的耐药基因型起到非常重要的作用。　　 ⑤Nilotinib能够逆转ABCB1/P-gp和ABCG2/BCRP介导的多药耐药，并且能够增加CD34+，CD38-病人细胞的化疗敏感性。对于指导临床联合用药起重要作用。　　 ⑥Nilotinib可能是ABCB1/P-gp的底物，可能通过抑制ABCB1/P-gp和ABCG2/BCRP药物外排泵功能在体内和体外逆转ABCB1/P-gp和ABCG2/BCRP介导的MDR。　　 ⑦Dasatinib对ABCB1/P-gp，ABCG2/BCRP，ABCC1/MRP1和ABCC4/MRP4没有逆转效果。