红芝LYL263混合培养产酶及其作用机理和应用研究

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漆酶是一种含铜的多酚氧化还原酶,在染料脱色,造纸废水降解、生物制浆等方面具有实用价值,纤维素酶和半纤维素酶在废纸脱墨、漂白等制浆工业中有重要应用;微生物混合培养能利用不同菌株作用效果的差异,使产酶量高于单一菌株,目前已经取得许多研究成果。本次研究通过红芝LYL263分别与白金针菇、苏平平菇、凤尾菇混合培养,筛选出了能提高红芝LYL263产酶的相容菌株-苏平平菇(下面简称苏平),两者混合产漆酶酶活为1346.4U/mL,比红芝LYL263单独培养产酶提高了35.7%,而纤维素酶和半纤维素酶的产酶量在混合培养后并无提高,通过进一步优化,当红芝LYL263与苏平的菌块接种比例为4:2时,其综合产酶量最高,最佳接种顺序是同时接入红芝LYL263和苏平。通过对红芝LYL263和苏平混合发酵的培养基进行优化,综合分析,确定最优发酵培养基成分为:最适碳源是葡萄糖、最适氮源为蛋白胨,当葡萄糖浓度为25g/L,蛋白胨浓度为1.5g/L,吐温-80浓度为1.0μL/L,稻草杆含量为0.1g/L时,综合产酶量最高,分别能达到:漆酶酶活2743.8U/mL、纤维素酶酶活92.3U/mL、半纤维素酶酶活55.1U/mL。通过对所产酶液酶学性质研究表明:pH和温度对红芝LYL263混合培养后所产的粗酶液中漆酶、纤维素酶和半纤维素酶性质的影响与单独培养所产酶并无差异,漆酶最适作用pH为4.5,最适作用温度为50℃,在偏酸性、低于30℃的环境下稳定性较好;纤维素酶和半纤维素酶的最适反应pH范围为6.0-7.2,最适反应温度50℃,在中性偏酸、低于50℃环境下稳定性较好。通过红芝LYL263与苏平在平板上共培养发现:两菌株在生长一段时间后产生密集的菌丝交织,并且在交织处呈现黄色;通过经0.451μm滤膜过滤后的无菌发酵液的相互作用,发现苏平能促进红芝LYL263产漆酶;通过非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分析,红芝LYL263混合培养后所产漆酶同工酶种类未发生变化,但浓度增加。将红芝LYL263和苏平混合培养所产粗酶液对甲基橙、活性艳蓝、孔雀绿、溴酚蓝和结晶紫五种染料进行脱色研究,甲基橙最佳脱色条件是:pH为4,温度为40℃,酶活为100U/mL,脱色率能达到73.2%;活性艳蓝最佳脱色条件是:pH为4,温度为40℃,酶活为100U/mL,脱色率能达到96.6%;孔雀绿最佳脱色条件是:pH为4,温度为30℃,酶活为100U/mL,脱色率能达到96.6%;溴酚蓝最佳脱色条件是:pH为3,温度为40℃,酶活为100U/mL,脱色率能达到77.5%;结晶紫最佳脱色条件是:pH为4,温度为30℃,酶活为75U/mL,脱色率能达到88.5%。将红芝LYL263和苏平混合培养所产粗酶液与红芝LYL263单独培养所产粗酶液分别处理造纸废水,当处理时间达到5h时,单独培养粗酶液处理效果趋于稳定状态,当处理时间达到6h时,混合培养粗酶液处理效果趋于稳定状态,并且对造纸废水的色度和COD的去除率较高;进一步优化混合粗酶液对造纸废水的降解条件:当体系中的pH值为5,反应温度为40℃,漆酶酶活为100U/mL时,色度去除效果最佳,脱色率为47.6%;当体系中的pH值为5,反应温度为50℃,漆酶酶活为125U/mL时,COD降解率达到63.8%。
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