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甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是全球最重要的油料作物之一,在我国广泛种植。适时开花不仅影响着甘蓝型油菜的产量和品质,也决定了其对生态区域的适应性。因此,开花期是甘蓝型油菜育种的重要目标性状之一。本课题组在前期研究中,从一个高世代群体中分离出在开花期上存在显著差异的NIL材料(L06和L04),二者在冬油菜环境下,开花期差异约为42天;在春油菜环境下,开花期差异亦达到10天。为了解释这两份材料中开花期变异的遗传机制,并为今后的油菜生育期育种提供优异的基因资源,本研究利用该NIL材料及其衍生的分离群体,通过图位克隆的策略成功定位并最终分离出一个控制开花的QTL位点(qFlowering Time-A2)。在此基础上,结合候选基因预测及转基因互补分析证实了导致花期变异的目标基因及其调控花期的分子机制,而染色体片段的局部非同源重组亦是导致开花期变异的重要因素之一。其主要研究结果如下:1.开花期位点qFlowering Time-A2的初定位和候选基因预测。利用NIL材料L06和L04杂交构建的NIL-F2分离群体,将该群体中控制花期的QTL,qFlowering Time-A2定位于A2染色体上约185 kb的物理区间内。在此基础上,利用一个包含2065单株的NIL-F2群体进一步将qFlowering Time-A2的候选区段缩小到86 kb的物理区段内,包含有23个候选基因。其中,编号为Bna A02g00370D的注释基因与拟南芥AT5G10140(FLOWERING LOCUS C)高度同源。拟南芥中研究表明FLC基因是春化途径中抑制开花的关键基因,因此,该注释基因极可能是qFlowering Time-A2的候选基因。双亲比较测序发现,在晚花亲本L04中,分离到两个与Bna A02g00370D序列高度同源的拷贝,二者主要的差异在于预测的第1个内含子插入一个长度为2.833 kp的片段的有无。因此,将无片段插入的拷贝命名为BnFLC.A2,有插入片段的拷贝命名为Bnflc.a2。而在早花亲本L06中,仅能分离出Bnflc.a2拷贝,有功能的BnFLC.A2拷贝则缺失。2.候选基因的转基因功能互补验证。从晚花NIL L04中扩增出覆盖BnFLC.A2完整基因的片段,并构建其植物表达载体PFGC5941-L04-BnFLC.A2。通过农杆菌介导的遗传转化将该载体导入到早花NIL L06中,在获得的PFGC5941-L04-BnFLC.A2转化后代的4个单拷贝T1代株系中,阳性单株的花期均值与晚花亲本L04的差异非常接近,但极显著晚于分离出的阴性单株(差值为23到30天)。此外,在不同的T1代家系中,BnFLC.A2的表达水平与开花期显著正相关。以上实验结果表明BnFLC.A2基因能够推迟L06的开花期,使其与晚花亲本L04相近。因此,BnFLC.A2即为qFlowering Time-A2的目的基因。3.BnFLC.A2/Bnflc.a2功能分化的原因分析。为了验证BnFLC.A2和Bnflc.a2在启动子区域存在的7处SNP变异和一个2bp In Del差异是否是造成基因表达差异的原因,我们分别构建了BnFLC.A2和Bnflc.a2启动子区连接GUS的载体并转入到拟南芥中。在阳性T2株系中,BnFLC.A2和Bnflc.a2的启动子GUS表达检测表明,在莲座叶、花瓣、萼片、花药以及柱头中检测到GUS的较强表达,在茎杆和枝梗等部位也能检测到明显活性,而在成熟的种子中则未检测到GUS表达。该结果表明,BnFLC.A2和Bnflc.a2启动子功能并未分化,而Bnflc.a2功能丧失可能是由于第1个内含子中长片段插入导致基因转录失活所致。4.BnFLC.A2及部分开花相关基因的时空表达谱。我们分别在冬油菜环境、春油菜环境和人工温室的环境下,分析了NIL L06和L04中BnFLC.A2及其可能的下游基因BnFT和Bn SOC1的表达特征。结果表明,在晚花材料L04中,低温春化处理能够抑制BnFLC.A2的表达,进而被其抑制的成花素基因BnFT及其下游基因Bn SOC1的抑制状态被打破,最终表现为促进开花。而在早花材料L06中,由于Bnflc.a2未表达,其内BnFT和Bn SOC1的表达量要显著高于L04,并最终使L06开花更早。因此,BnFLC.A2与拟南芥FLC具有非常保守的调控花期的功能。5.HEs(homeologous exchanges)的发生。我们对双亲L06和L04进行了重测序分析,同时结合双亲目标基因比较测序的结果,我们发现在亲本中发生了A2染色体Bnflc.a2基因所在区段将C2染色体BnFLC.C2基因所在区段进行的亚基因组的同源重组交换(HE)。NIL材料中位于C2染色体上包含Bnflc.a2拷贝的区段,是由于A2/C2的非同源重组后被A2染色体取代所形成的。因此,在早花NILL06中,A2和C2染色体均只包含相同的功能缺失的Bnflc.a2拷贝所在区段,而晚花NILL04包含一个位于A2染色体上功能正常的BnFLC.A2拷贝和一个位于C2染色体上功能缺失的Bnflc.a2拷贝。495份自然群体分析表明,由HE导致形成的仅包含Bnflc.a2拷贝的材料是一种稀有突变,对开花期变异有着显著的影响。该研究案例证实HE是导致甘蓝型油菜开花期变异的重要因素之一。