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炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的一种人畜共患的烈性传染病,它具有病程发展快,致死率高的特点。在炭疽芽孢感染的早期,没有明显特点的症状,较难作出诊断。一旦症状迅速发展,即使使用抗生素,通常病人也会死亡,这是由于在机体中已经出现了致死剂量的炭疽毒素。抗生素只能杀死菌体,并不能清除毒素。因此,在进行抗生素治疗的同时,针对炭疽毒素的抗毒素治疗对于挽救病人生命是非常必要的。炭疽毒素包括两种A-B型毒素,每种都有不同的催化部分——水肿因子(EF,edema factor)和致死因子(LF,lethal factor)。两个催化部分共享一个结合的B部分,保护性抗原(PA,protective antigen),结合后的完整毒素称为水肿毒素(ET,edema toxin)和致死毒素(LT,lethal toxin)。炭疽对机体的伤害主要是由于ET和LT的共同作用。ET和LT进入细胞发挥作用的过程如下所示: 1、PA与其在细胞膜上的受体结合(CMG2或TEM8);2、细胞膜上的furin蛋白酶裂解PA产生PA63;3、PA63单体形成七聚体的前体孔结构;4、LF或EF与七聚体结合;5、内吞作用导致毒素进入细胞;6、毒素在细胞内被释放到细胞质中,产生细胞毒性作用。本研究根据炭疽毒素进入细胞的机理,设计了两种阻止炭疽毒素进入细胞的策略并对其进行了研究。策略一:可溶性受体作为炭疽毒素抑制剂从理论上来说,可溶性受体可与膜受体竞争结合其配基,导致配基与膜受体的结合受到抑制,从而抑制了配基的生理或病理功能。为了探讨炭疽毒素可溶性受体是否能够作为炭疽毒素的抑制剂,进行了以下的工作:一、炭疽毒素可溶性受体的表达纯化获得一定纯度的高活性的可溶性受体是研究的基础。我们使用大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统,表达了三种不同形式的炭疽毒素可溶性受体。重组蛋白使用Ni柱和Superdex75凝胶过滤柱得到纯化。二、重组可溶性炭疽毒素受体与PA、Ⅳ型胶原结合活性及细胞保护活性的分析ELISA实验表明我们表达的三种可溶性受体都与PA有较强的结合活性,但与文献报道不同的是:表达的三种可溶性受体与目前人们推测的CMG2可能的天然配基的胶原Ⅳ没有结合活性。体外细胞保护实验中,它们都可以有效中和炭疽毒素,但中和活性有所差别。此外,意外发现CMG2 VWAC175A能够结合牛血清白蛋白和人血清白蛋白,但血清白蛋白并不干扰CMG2 VWAC175A的细胞保护活性。三、重组可溶性受体的体内毒素中和活性分析使用F344雄性大鼠为炭疽毒素攻毒模型,评价了重组可溶性受体体内毒素中和活性。结果表明,重组可溶性受体可以在体内有效中和炭疽致死毒素,使动物存活下来。四、重组可溶性炭疽毒素受体的体内稳定性的初步分析使用毒素攻毒的动物模型,我们初步研究了可溶性受体在体内的稳定性,发现其在体内维持中和毒素活性的时间极短,分析认为造成这种现象的原因可能在于体内存在大量的受体的天然配基,天然配基与受体的结合会影响进入体内的重组蛋白与PA的结合。结论:尽管可溶性炭疽毒素受体能够在动物体内有效中和炭疽毒素,但过短的中和活性维持期对于将其作为一种炭疽毒素抑制剂的前景不容乐观。策略二:融合蛋白LFn-EFn,潜在的炭疽毒素新型抑制剂理论上可以将PA63七聚体作为炭疽毒素抑制剂作用的靶点,使用竞争性或非竞争性抑制剂封闭PA63七聚体上LF/EF的结合位点,就能阻止LF或者EF进入细胞内,使LF或者EF不能与细胞内的底物接触,从而阻止它们发挥各自的细胞毒性活性。依照这种思路,本研究以LF和EF为基础,探索发展新型的炭疽毒素竞争性抑制剂。主要完成了以下的工作:一、LF突变体(LFM),LFn、EFn及LFn27-263抑制活性研究使用大肠杆菌表达系统表达了LFM,LFn、EFn和27LFn(去除了LFn的N端的27位残基),重组蛋白通过Ni柱及Superdex75柱得到了纯化。炭疽毒素攻毒的细胞模型显示它们的毒素抑制活性大小依次为LFM>LFn27>LFn=EFn。Biacore检测发现它们与PA63亲和力的差异造成了抑制活性的差别。二、LE及27LE的抑制活性研究构建表达载体在大肠杆菌中表达了2个融合蛋白:LE和27LE。这两个蛋白以完全可溶的形式在大肠杆菌的胞内表达。纯化获得高纯度的目的蛋白。毒素攻毒的细胞模型显示它们可以有效抑制炭疽毒素的细胞毒作用。Biacore分析结果表明,与LFn单体相比,LE/27LE融合蛋白与PA63的亲和活性得到大的提高。这意味着LE/27LE与PA63七聚体的的亲和活性也得到增加,从而提高中和毒素的能力。这个结果支持我们的推测:LE/27LE可以同时结合两个PA63七聚体上的结合位点。三、重组蛋白27LE的体内毒素中和活性分析使用F344雄性大鼠为炭疽毒素攻毒模型,评价了重组蛋白27LE体内毒素中和活性。结果表明,重组蛋白可以在体内有效中和炭疽致死毒素,使动物存活下来。从目前的实验结果来看,融合蛋白27LE在体内具有一定的稳定性,能够在一定的时间内在体内保持足够的浓度来清除炭疽杆菌持续产生的毒素,因此,可以在芽孢攻毒的动物实验中与抗生素联合使用,对其进行进一步的评价。结论:我们构建的融合蛋白27LE在体内不但具有很好的毒素中和活性,而且具有一定的稳定性,能够在一定的时间内在体内保持足够的浓度来清除炭疽杆菌持续产生的毒素,因此,可以在芽孢攻毒的动物实验中与抗生素联合使用,对其进行进一步的评价。