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植物内生真菌是一种具有潜在研究价值的微生物资源,不仅能促进宿主植物体内次生代谢产物的转化与合成,而且内生真菌本身所产生化学结构特殊活性多样的次级代谢产物,成为寻找新型生物活性成分的重要新资源,突破了日益枯竭的植物资源稀缺的限制,具有极大的开发潜力和应用价值本文选择银杏(Ginkgo biloba)这一我国特有的植物资源,从其健康组织分离其内生真菌,初步评价其活性;利用分子生物学方法进行分类鉴定;并以活性示踪为导向,对高活性菌株的代谢产物中抗菌作用成分进行分离纯化。主要研究结果如下:1.采用组织培养法,结合表面消毒验证试验从健康的银杏组织中分离得到55株内生真菌,36株来自叶片组织;19株来自根组织。以苹果炭疽病原菌(Pezicula malicorticis)、苹果腐烂病原真菌(Valsa mali)、辣椒疫霉病原菌(Ph XTophthora capasici)、番茄枯萎病原真菌(Verticillium tricorpsis)、小麦赤霉病原真菌(Fusar ium graminearum)和梨黑星病原真菌(Venturia nashicola)六种植物病原真菌为作用对象,采用平板对峙试验评价内生真菌的抑菌活性,测定内生真菌对供试病原菌拮抗作用,结果显示33株内生真菌对至少一株供试植物病原真菌具有拮抗活性,表明银杏组织中含有丰富的抗菌活性内生真菌。菌株GBT07对5种供试病原真菌表现出强烈的拮抗作用。2.通过形态学初步鉴定排除相似菌株后,采用ITS r DNA序列分析了33株内生真菌的分类归属,结果显示它们分别属于9个属:刺盘孢属(Colletotrichum spp.)9株;黑孢霉属(Nigrospora spp.)7株;小丛壳属(Glomerella spp.)5株;拟茎点霉属(Phomopsis spp.)3株;球座菌属(Guignardia spp.)3株;叶点霉属(Phyllos ticta spp.)2株;镰孢属(Fusarium spp.)2株;炭团菌属(Hypoxylon spp.)和黑管菌属(Bjerkandera spp.)各1株。确定内生真菌GBT07为腐皮镰孢(Fusarium sola ni),命名为腐皮镰孢GBT07(Fusarium solani GBT07)。3.以菌体生物量、发酵液抑菌活性为指标,分析了不同的碳、氮源,以及温度、初始酸碱度的摇瓶发酵条件,初步确定了适合其扩大培养的生长条件。选用可溶性淀粉、硝酸钠作为碳、氮源,28℃,初始p H=7,以此作为扩大培养的初选条件,获得含抑菌活性成分较多的发酵液和一定数量的菌体。采用机械搅拌式发酵罐扩大培养菌株,分别在若干个时间点取样,测试相应时间发酵液的抗菌活性及菌体生物量,并与摇瓶发酵做相应的比较。罐发酵3d时每100m L发酵液中菌体生物量达到最大(1.65±0.052)g,4d时抗菌活性最高为(33.56±1.34)%;摇瓶发酵5d时每100m L发酵液中菌体生物量达到最大(0.82±0.035)g,7d时抗菌活性最高为(53.20±0.76)%。4.液体发酵培养GBT07菌株,得到的菌丝体采用乙酸乙酯提取;发酵液利用大孔吸附树脂HPD600富集,甲醇洗脱。抑菌试验结果表明,浓度200mg·L-1时,GBT07菌丝和发酵液浸膏对苹果腐烂和苹果炭疽等病原真菌菌丝生长有着良好的抑制作用。以活性追踪为导向,选取苹果炭疽为指示菌株,采用硅胶柱层析法,菌丝浸膏经由2次柱层析,在乙酸乙酯:甲醇(v:v=20:1)部位分离得到的组分Fr2-9,对苹果炭疽病原菌的抑制作用十分明显,72h浓度20mg·L-1对苹果炭疽抑制率为(86.93±1.37)%,EC50值2.57mg·L-1,较之浸膏活性有了大幅提高;发酵液浸膏经由2次柱层析,在由三氯甲烷:甲醇(v:v=30:1)部位分离得到组分Fr2-8,对苹果炭疽病原菌抑制作用强烈,72h浓度20mg·L-1对苹果炭疽的抑制率为(78.50±0.97)%,较之浸膏活性有了大幅提高。抗菌活性化合物在Fr2-9和Fr2-8两个组分中较为集中,推测很可能是同一种化合物。经p-HPLC分离纯化出一种已知化合物—β-腺苷(β-Adenosine)7mg,有文献报道它对植物幼苗生长有促进作用。