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淀粉是植物植物种子的主要成分,是最重要的碳能量储存形式。食物中的80%的能量由淀粉提供,其也作为重要的工业原料,广泛应用于能源、化工等领域。目前,淀粉已经成为一种重要的商业产品。在玉米籽粒中,70%左右是淀粉,其在籽粒中的含量及品质直接影响玉米的产量和品质。因此深入开展淀粉生物代谢机理研究,不仅能完善淀粉代谢机理的理论基础,而且对进一步人工控制淀粉合成过程,改善淀粉含量和品质,从而达到提高玉米产量和品质的目的具有十分重要意义。淀粉的生物合成过程主要牵涉到四种类型的酶：腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase, AGPase),淀合成酶(starch synthase, SSs),淀粉分支酶(starch branching enzymes, SBEs),淀粉去分支酶(starch-debranching enzymes, DBEs)。尽管主要只有四种类型的酶,但是各种类型的酶都包含有多种同工酶,并且这些酶之间相互协调行使功能,使得淀粉合成过程非常复杂；淀粉降解过程主要牵涉到几种酶类：葡聚糖水二激酶(glucan-water dikinase, GWD),磷酸葡聚糖水二激酶(phosphogulucan-water dikinase, PWD),异淀粉酶(isoamylase, ISA),β淀粉酶(β-amylase)和a-淀粉酶(a-amylase)等,另外还有些十分重要的转运蛋白如：MEX1等,使得降解掉的多糖链或单糖能够及时的运输处质体,这些降解酶和转运蛋白均十分重要,彼此之间相互协调,其突变会直接导致淀粉降解过程的延缓甚至终止。目前,这些酶的大部分已经有了突变体或得到了转基因材料,对其功能进行了解析,只有少数类别的同工酶还没能分离得到突变体。研究表明,这些酶并不是独立的行使功能,很多酶类是通过形成复合体来行使功能,因此深入研究酶类行使功能的机制,对从本质上解析淀粉代谢机理具有重要意义。本研究着力于用突变体解析质体中碳流动的机理和淀粉代谢的酶蛋白功能相互作用这两方面。本论文主要研究AGPase和isoamyalse的功能。AGPase是淀粉合成过程中的限速酶,其活性的高低能够直接影响淀粉的含量。在玉米中,AGPase有多种类型的同工酶,一共有七个基因来编码这些亚基,其中4个基因编码小亚基,3个基因编码大亚基。我们对这7个基因的表达模式和亚基组合模式进行了研究,同时,从转座子数据库中,分离纯化出其中两个基因：leafL和embryoS的突变纯合体,并对这两个突变体进行了分析,以解析这两个基因的功能；研究表明,异淀粉酶(isoamylase)不仅在淀粉4降解中起重要作用,其在淀粉合成过程中也扮演重要角色。我们分离纯化得到了ISA和SSⅢ的双突变体,其相对于单突变体表现出特异的表型。我们对该突变体进行了分析,以解析酶的功能相互作用的机制。本研究主要取得了以下研究结果：1、明确了AGPase基因的表达模式：具有组织和发育阶段表达的特异性；在玉米种,AGPase的亚基可能的组合模式有：SH2/BT2a、SH2/LEAFS、SH2/EMBRYOS、 EMBRYOL/EMBRYOS和LEAFL/LEAFS。2、对一个特殊的AGPase同工酶(EMBRYOL+LEAFS)进行了酶动力学特性和热稳定性进行了分析：EMBRYOL+LEAFS AGPase相对于玉米野生型AGPase (SH2+BT2a), Km值更小,对底物具有更高的亲和性,而且其耐热能力表现得更好。这对进一步的改造AGPase,找到具有特殊动力学特性和耐热能力的AGPase,从而进一步得到含有优良AGPase特性的转基因植株具有重要意义。3、对20多个AGPase基因的转座子突变类型材料进行纯化,经过多代自交,得到两个基因的有效突变纯合体：leafL和embryoS,其表型明显,直接影响淀粉的合成。LeafL基因的突变能直接导致玉米叶片淀粉含量降低77%,而embryoS基因的突变会导致玉米胚的淀粉含量减少54%,而且两个突变体分别能导致胚乳淀粉6%和6.4%的降低。这个结果正好验证了Hennen-Bierwagen et al (2009)提出的淀粉合成酶蛋白模型：在质体中,蛋白、脂肪和淀粉等碳水化合物之间可能利用质体AGPase催化的这个可逆反应来控制它们之间的平衡。4、分离得到isa2-339/dul1双突变的纯合体材料,其种子表现出特殊的表型：鉴于dul1单突变和suagaryⅠ单突变的种子表型之间,ISA2和SSⅢ双突变导致了淀粉的大量减少和植物糖原的积累,淀粉和水溶性糖(WSP)的结构也发生了变化。本研究的主要创新点如下：1、首次全面系统的分析玉米所有AGPase基因,明确其表达谱和组合模式。2、首次鉴定分离出控制叶片和胚淀粉合成的AGPase酶基因的突变体,并证明质体AGPase在控制碳流上的重要作用。3、对特殊AGPase同工酶(EMBRYOL+LEAFS)进行了动力学特性分析,并发现其动力学特性和耐热特性优于玉米中主要的AGPase形式(SH2+BT2)。这对一直进行着的AGPase改造项目,找到更优特性的酶研究具有十分重要意义。4、首次鉴定分离出isa2-339/dull双突变体,其表现出特殊的表型,这为研究酶蛋白之间的相互作用,验证以复合体形式行使功能的假设具有重要意义。