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目的检测TCDD暴露对HSC诱导的活化作用,并且探讨TCDD引起肝纤维化的潜在分子机制。方法(1)动物分组及处理,将21只6周龄雄性C57BL/6J小鼠适应性喂养一周后,随机分成三组,每组7只,分别为对照组、10μg/kg·bw·w TCDD剂量组、25μg/kg·bw·w TCDD剂量组。于分组后的0,7,14,21,28以及35 d,给予小鼠腹腔注射组别相应剂量的玉米油和TCDD。在第42天处死小鼠,根据体重,随机从对照组、10μg/kg·bw·w组以及25μg/kg·bw·w组挑选4只小鼠,取其肝脏进行病理分析和组织形态学观察。剩余小鼠取其肝脏,冻存于液氮,分别用于提取组织总RNA和总蛋白。(2)细胞培养及处理,采用HSC-T6作为体外细胞培养实验的细胞系。分别给予0.1、1、10、25、100nM等不同剂量的TCDD刺激,采用DMSO作为对照组,刺激细胞72h。(3)以天狼猩红染色观察小鼠肝纤维化病理改变,以H&E染色观测肝脏一般病理改变。运用realtime-PCR法检测肝脏α-SMA和Coll1A1基因的mRNA表达水平。运用Western blot法检测α-SMA、Coll1A1、Akt、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白或磷酸化蛋白水平。运用酶联免疫吸附法(ELISA)检测TCDD处理HSC-T6细胞后的上清液中TNF-α和IL-6的含量。(4)在HSC-T6细胞培养中,给予Akt抑制剂,运用Western blot法对细胞总蛋白中的前述相关蛋白或磷酸化蛋白表达水平再次进行检测,运用ELISA方法检测细胞上清液中的TNF-α和IL-6含量。结果(1)天狼猩红染色结果表明,TCDD暴露组小鼠肝脏的胶原沉积明显增加;H&E染色结果表明TCDD暴露组的小鼠肝脏有炎性细胞浸润在肝脏门静脉周围。(2)TCDD处理可以增加C57BL/6J小鼠肝组织和HSC-6T中α-SMA(HSCs活化标志物)和Coll1A1(肝纤维化标志物)的mRNA表达和蛋白水平。(3)TCDD处理可以增加C57BL/6J小鼠肝组织和HSC-6T中Akt的磷酸化水平,在C57BL/6J小鼠肝组织p-Akt与SYP(HSC标志物)之间存在免疫荧光共定位,说明Akt的活化发生HSCs中。(4)TCDD处理可以增加C57BL/6J小鼠肝组织和HSC-6T中NF-κB p65的磷酸化水平(p-p65),核浆分离和细胞荧光实验证实p-p65的增加主要在HSC细胞核中。(5)在HSC-6T中使用Akt抑制剂LY294002预处理后再进行TCDD暴露,细胞总蛋白中的p-Akt、p-p65和α-SMA的蛋白或磷酸化蛋白水平均较未以LY294002预处理组下降;同时,细胞荧光检测发现TCDD处理使HSC-6T中p-p65入核增加、细胞上清液中TNF-α和IL-6含量增加,而LY294002预处理可使p-p65入核减少、TNF-α和IL-6含量升高受抑制。结论(1)TCDD暴露可以诱导C57BL/6J小鼠的HSCs活化、促进小鼠肝纤维化损伤;(2)TCDD暴露通过活化Akt/NF-κB信号通路促进炎症因子分泌,并激活HSC,诱导肝纤维化;(3)Akt抑制剂对TCDD暴露所致HSC活化及肝纤维化可能有一定防治作用。