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背景肿瘤发生发展过程中,内皮细胞形成新生血管为肿瘤提供生长所需的营养和氧气。根据大量文献报道肿瘤血管的新生受到血管生成因子和血管生成抑制因子的调节。肿瘤血管新生的主要方式是出芽式血管新生,最近研究发现内皮细胞代谢在血管出芽过程中扮演很重要的角色。在血管出芽过程中,代谢改变会驱动内皮细胞分化成尖端细胞和茎细胞等不同的表型,不同的表型又会利用代谢发挥不同的功能。其中尖端细胞利用糖酵解提供能量伸出伪足向前迁移,茎细胞利用糖酵解提供能量并且转换糖酵解中间体进行生物合成而促进其增殖,所以内皮细胞糖酵解与内皮细胞出芽有很密切的关系。肿瘤微环境会产生很多炎症因子,关于这些炎症因子与内皮细胞功能的研究很广泛,但是它们是否可以调节内皮细胞代谢,目前还没有报道。肿瘤坏死因子α(TNFα)作为肿瘤微环境中极其重要的一个炎症因子,在抗肿瘤过程中扮演重要角色,据文献报道TNFα可以作用于内皮细胞,抑制内皮细胞增殖,抑制血管生成,从而达到抗肿瘤的目的,但是具体机制未被完全阐明。然而TNFα是否能够调节内皮细胞代谢进而影响血管生成,目前尚不清楚。因此,在本论文中,我们选择一个小鼠血管内皮细胞系sEND.1细胞作为研究对象,从细胞和分子水平来探究TNFα对内皮细胞糖酵解的影响以及其分子作用机制。我们发现TNFα通过激活NFκB下调了sEND.1细胞葡萄糖转运体1(Glut1)和己糖激酶2(HK2)的表达,进而抑制了细胞糖酵解。目的探讨TNFα对内皮细胞系sEND.1细胞糖酵解的影响及分子机制。方法1.不同浓度0、1、10、50、100ng/ml的TNFα作用于小鼠血管内皮细胞sEND.1细胞系,采用海马能量代谢检测方法检测TNFα对sEND.1细胞系细胞外排酸速率ECAR的影响情况;2.通过流式细胞分析术检测TNFα刺激sEND.1细胞后摄取2-NBDG的情况来反应葡萄糖摄取的多少;3.通过比色法检测TNFα刺激sEND.1细胞后的吸光度来反应乳酸的产量;4.通过逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测TNFα刺激sEND.1细胞后Glut1,HK2,PFKFB2等基因的表达情况;5.通过免疫印迹法(WB)检测TNFα刺激sEND.1细胞后Glut1,HK2,PFKFB2等蛋白的表达情况;6.通过免疫印迹法(WB)检测TNFα刺激sEND.1细胞后p-NFκB(p-P65),NFκB(P65),JNK2等信号通路蛋白的表达情况;7.通过抑制NFκB信号通路后,再用海马能量代谢分析仪检测sEND.1细胞内排酸速率的情况,以及用逆转录聚合酶链式反应和免疫印迹法来检测与糖酵解相关的酶的基因和蛋白表达情况;8.通过主动脉环出芽实验以及体外成管实验检测TNFα对血管出芽以及对sEND.1细胞成管的影响。结果1.海马能量代谢结果:不同浓度TNFα作用于sEND.1细胞6h后,实验组,即TNFα1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml组的ECAR值均被下调。经统计学分析,各个实验组数据与对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.2-NBDG摄取实验:10ng/ml TNFα作用于sEND.1细胞6h后,葡萄糖摄取被下调。经统计学分析,实验组数据与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.乳酸产生结果:10ng/ml TNFα作用于sEND.1细胞6h后,吸光度OD值明显减少,显示经刺激后乳酸产量减少。经统计学分析,实验组数据与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.qRT-PCR结果:10ng/ml TNFα作用于sEND.1细胞6h后,Glut1,HK2,PFKFB2等基因的表达均降低。经统计学分析,实验组数据与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.免疫印迹(WB)结果:10ng/ml TNFα作用于sEND.1细胞6h后,Glut1,HK2,PFKFB2等蛋白的表达均降低。6.免疫印迹(WB)结果:10ng/ml TNFα作用于sEND.1细胞不同时间后,p-NFκB(p-P65)被明显激活,并且从刺激10分钟就开始激活。JNK2,AKT等其他蛋白信号通路未发生明显改变。7.用SC75741抑制NFκB信号通路后,sEND.1细胞ECAR被逆转升高;聚合酶链式反应结果和免疫印迹结果显示NFκB被抑制后Glut1,HK2在基因和蛋白水平的表达被逆转升高。实验组数据与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。8.出芽以及成管实验结果:TNFα刺激主动脉环后,发现主动脉环出芽数量及分支明显减少,TNFα刺激sEND.1细胞在基质胶中成管3h后,发现明显成管被抑制,数量减少。合并乳酸后,主动脉环出芽数量及成管数量恢复正常水平。结论1.TNFα抑制sEND.1细胞糖酵解。2.TNFα通过激活NFκB抑制Glut1和HK2的表达,进而抑制sEND.1细胞糖酵解。3.TNFα抑制血管出芽可能是由于抑制糖酵解引起的。