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目的:构建含沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)蛋白酶样活性因子(chlamydial protease-like activity factor, CPAF)免疫活性区(200～338 aa)基因的重组表达体,在大肠杆菌中进行诱导表达,纯化表达产物并进行免疫原性和抗原性分析,建立间接ELISA法和IIF法检测Ct感染的临床标本,分析其敏感性和特异性,为制备Ct临床检测试剂盒奠定基础。方法:通过生物信息学分析和查阅资料,筛选并挑选Ct CPAF基因优势抗原表位,以D型Ct基因组DNA为模板,高保真聚合酶链反应扩增目的片断,将其亚克隆至原核表达载体pGEX-6p-2中,构建重组质粒pGEX-6p-2/CPAF,然后转化至表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达,利用SDS-PAGE和Western-Blot分析和鉴定表达产物;重组蛋白经稀释透析复性后,用GST琼脂糖凝胶FF纯化柱进行纯化,紫外吸收法测定纯化蛋白浓度。用纯化的Ct CPAF重组蛋白包被微孔板,建立间接ELISA方法,检测Ct参比血清和临床Ct阳性血清,同时与晶美公司Ct ELISA试剂盒检测结果进行对比分析,根据重组蛋白与Ct阴、阳性血清的反应情况,评价该重组抗原在Ct感染血清学诊断中的应用价值。同时用纯化的Ct CPAF重组蛋白免疫新西兰兔,间接ELISA方法检测免疫兔血清中Ct CPAF多克隆抗体的效价;并用溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B对抗血清进行纯化,纯化后的抗血清作为一抗建立间接ELISA法和IIF法测定临床分泌物标本中的Ct CPAF抗原,与PCR法检测结果进行对比分析,评价该抗血清在临床标本抗原检测中的应用价值。结果:软件分析Ct CPAF基因的抗原表位选择了Ct CPAF基因的674～1 090bp位碱基序列为目的基因(片段长度为417bp,编码139个氨基酸);PCR扩增得到大小约为400bp的目的片断;构建的重组质粒经酶切鉴定和测序鉴定证明其中插入片断为Ct CPAF目的基因,测序结果与Genbank上登录序列完全一致;SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,重组表达菌表达了一相对分子量(Mr)约为43×103的目的蛋白条带,目的蛋白在菌体细胞内主要以包涵体形式存在;经GST琼脂糖凝胶FF纯化柱纯化获得了纯度在95%以上的重组蛋白。Western-blot检测其能与Ct阳性血清发生特异性反应;重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA法检测Ct参考血清,其阴、阳性符合率均为100%;用自建的间接ELISA法和晶美公司Ct ELISA试剂盒分别检测250份阴、阳性血清,两种方法的符合率IgM为96.8%,IgG为98.4%。利用纯化的Ct CPAF重组蛋白免疫新西兰兔,间接ELISA法测定兔免疫血清特异性抗体效价在1:16 000以上;纯化后的抗血清作为一抗建立间接ELISA法和IIF法检测临床分泌物标本中的Ct CPAF抗原,建立的间接ELISA法及IIF法与上海复星公司Ct PCR试剂盒检测结果符合率分别为91.90%和90.00%。结论:1、成功构建了pGEX-6p-2/ CPAF原核表达体,将其转化至E.coli BL21(DE3)后表达出了一相对分子量(Mr)约为43×103的重组蛋白;2、Ct CPAF重组蛋白具有较好的免疫原性,能刺激新西兰兔产生高效价的特异性抗体;3、Ct CPAF重组蛋白具有良好的抗原性,能与Ct感染者阳性血清特异性结合,可应用于Ct血清学诊断;4、以Ct CPAF重组蛋白免疫新西兰兔制备的多克隆抗体为一抗建立的间接ELISA法和IIF法具有良好的敏感性和特异性,可望应用于Ct感染的抗原检测。