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乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)的感染严重影响着人类的健康,它能够引起急、慢性病毒性肝炎。急性感染后,有5～10％的成年人发展为持续感染,最终可以导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌。目前全球约有3.5亿乙型肝炎病毒慢性感染者,迄今为止,还无有效的药物能够完全治愈乙肝患者。治疗慢性乙型肝炎必须先了解其致病机制,以寻找合适的治疗方法,但由于缺乏合适的HBV感染小动物模型,严重阻碍乙型肝炎病毒生物学和抗病毒治疗方法的研究。 针对上述问题确立本课题的研究目的:利用水动力转染技术基于免疫正常的小鼠建立以萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase, Fluc)为报告基因标记的HBV表达小鼠模型,以探讨HBV的致病机制,并用此模型进行相关疫苗的评价,为开发治疗性疫苗和抗病毒药物奠定基础。具体研究内容如下: 1.Fluc标记的HBV1.2倍基因组载体的构建及体外表达 以pAAV/1.2HBV质粒为模板,PCR扩增带有反向重复序列(ITR)的1.2倍HBV基因组片段,反向插入真核表达载体 pGL3-CP-Fluc中,构建 Fluc标记的HBV基因组表达质粒pGL3-CP-Fluc-HBV1.2,并将此质粒转染至Huh-7细胞中,检测其在细胞的表达水平。结果表明,pGL3-CP-Fluc-HBV1.2在细胞中高水平表达Fluc,并可以正常分泌HBsAg,说明了我们所构建的带报告基因的HBV载体能够在Huh-7细胞中表达。 2.报告基因标记的HBV稳定表达小鼠模型的建立 通过水动力转染将10μg质粒pGL3-CP-Fluc-HBV1.2分别导入C57BL/6和BALB/c小鼠肝细胞内,观察目的基因在小鼠体内复制表达。 在BALB/c小鼠中,血清HBsAg表达水平在转染后第1 w内迅速升高,随后快速下降,在转染后第70 d HBsAg阳性率仅为为40％。而在C57BL/6小鼠中,HBsAg表达水平下降较缓慢,在转染后第70 d HBsAg阳性率为80％,血清病毒滴度在转染后第1 d平均达到3.89×104copies/ml,在第4和7 d达到最高,分别为1.61×105和1.31×105copies/ml,随后开始下降,在转染的第70d仍维持在10 copies/ml以上。免疫组化检测C57BL/6小鼠肝脏HBcAg的表达,结果显示在转染后第3d HBcAg高水平表达,第135d HBcAg仍有表达,但表达水平降低。 活体荧光成像实时检测小鼠肝脏Fluc,结果表明两组小鼠均能持续高水平表达Fluc,转染后第7w Fluc的表达量仍然超过106 photons/sec。 因此,本研究建立的报告基因标记的HBV小鼠模型能够稳定表达 HBV标志物和Fluc,为进一步进行HBV的疫苗评价提供了基础。 3.报告基因标记的HBV稳定表达小鼠模型在疫苗评价中的初步应用 构建编码HBcAg的DNA疫苗pVAX1-HBc,以pVAX1空载体作对照,通过电穿孔法免疫C57BL/6小鼠后,水动力转染pGL3-CP-Fluc-HBV1.2质粒,观察小鼠体内HBV标志物和Fluc的表达,并结合血清ALT检测和肝脏组织学分析,探讨HBV特异性CTLs在病毒清除过程中的作用机制。pVAX1-HBc免疫的小鼠血清中均检测到HBcAb。在pGL3-CP-Fluc-HBV1.2转染后第21 d,pVAX1-HBc免疫组小鼠血清HBsAg、HBV DNA和肝脏Fluc表达水平与对照组相比显著降低,至28 d三者表达完全消失;这可能是由于HBV特异性CTLs在清除病毒的同时导致了肝细胞的破坏,从而引起肝脏Fluc表达的降低。血清ALT和肝脏HE染色结果也证实, pVAX1-HBc免疫组在转染后第14和21 d血清ALT值显著高于对照组,肝细胞的炎症反应范围也比对照组更为广泛。进一步证实了HBV特异性CTLs能够通过细胞毒作用抑制病毒的复制。 用重组(酵母)乙肝表面抗原和生理盐水皮下免疫C57BL/6小鼠后,水动力转染pGL3-CP-Fluc-HBV1.2,观察小鼠体内HBV标志物和Fluc的表达。表面抗原免疫组小鼠血清中检测到HBsAb,转染质粒后的第1 d HBsAg就呈低水平的表达,随后快速下降直至阴性;血清中HBV DNA在转染第7 d开始明显降低,至21 d降至阳性临界值以下。而生理盐水免疫组小鼠血清HBsAg和HBV DNA的表达均持续阳性。活体荧光成像检测肝脏Fluc的活性表明Fluc表达在两组中没有明显差异。说明了HBsAg蛋白疫苗免疫的小鼠主要通过体液免疫抑制体内感染。 综上所述,本研究构建的报告基因标记的HBV表达质粒能够在体内外高水平的表达,以此质粒为基础建立了报告基因标记的HBV稳定表达小鼠模型。利用建立的小鼠模型对HBV疫苗进行初步评价,结合报告基因和HBV标志物的检测结果可判断疫苗所激发的免疫类型,并能够对HBV特异性CTLs清除病毒的作用机制进行研究。此模型评价体系具有灵敏、快速、方便等特点,也为HBV致病机制的探讨、治疗性疫苗的研发和抗病毒治疗的研究奠定了一定基础。