ApoE-/-AS小鼠肝脏胆固醇代谢相关miRNA-mRNA网络构建及化瘀祛痰方调控机制研究

来源 :辽宁中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:kwx313
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目的:通过建立高脂喂饲ApoE-/-动脉粥样硬化小鼠模型,利用mRNA转录组学研究与miRNA测序技术构建胆固醇代谢相关miRNA-mRNA分子网络,阐明ApoE-/-小鼠脂代谢紊乱分子机制及化瘀祛痰方调控作用。材料与方法:10只C57BL/6J小鼠为空白对照组、20只ApoE-/-小鼠为模型组和中药组。空白对照组小鼠每天用普通小鼠饲料喂食,模型组和中药组每天给予高脂饲料喂养。8周后20只ApoE-/-小鼠随机分为模型组和中药组。中药组予化瘀祛痰方药,含生药20g/kg体质量灌胃,空白对照组和模型组小鼠给予等量蒸馏水灌胃。在给药期间内,三组小鼠喂养饲料不变,给药8周后取材。生化分析仪检测小鼠血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇水平(HDL-C)、HE染色观测肝脏组织形态学变化、油红O染色观测肝脏脂质沉积情况。采用转录组技术技术分析各组小鼠肝脏胆固醇代谢相关基因mRNA的差异表达,miRNA测序技术筛选调控胆固醇代谢差异基因mRNA的miRNA。q RT-PCR方法验证部分差异mRNA与miRNA的表达趋势并明确化瘀祛痰方的干预作用。结果:1.各组小鼠血脂水平变化与空白对照组比较,模型组小鼠血清TC、TG和LDL-C水平显著上升,HDL-C水平显著下降(p<0.01);与模型组比较,化瘀祛痰方治疗后TC、TG和LDL-C水平显著降低(p<0.01),HDL-C水平有上升趋势但没有统计学意义(p>0.05)。2.各组小鼠肝脏组织形态学变化与脂质沉积情况HE染色结果显示:正常对照组小鼠肝组织形态结构正常,肝细胞形态结构清晰且大小均匀,核仁清晰;模型组小鼠肝脏细胞排列紊乱且肿胀,脂肪空泡变性严重,经化瘀祛痰方治疗后,肝脏细胞肿胀与空泡样变性明显改善。油红O染色结果显示:空白对照组小鼠肝组织没有油红O着色的沉积脂质;模型组小鼠肝脏存在较多的油红着色脂滴;经化瘀祛痰方治疗后,ApoE-/-小鼠肝脏油红着色脂滴明显减少。3.ApoE-/-小鼠肝脏胆固醇代谢相关基因mRNA表达与其调控miRNA变化转录组检测结果发现,与空白对照组比较,模型组小鼠肝脏胆固醇代谢相关基因SREBP2、PCSK9、LDLR、HMGCR、CYP7A1表达下调。在调控它们的miRNA中,有72个差异miRNA,其中14个下调,58个上调,总体呈现负调控趋势。72个miRNA与5个靶基因形成了一个分子调控网络,其中有9个miRNA对3个以上靶基因具有负调控作用,miR-351-5p和miR-676-3p能够分别调控4个基因,分别是HMGCR、LDLR、PCSK9、SREBP2和LDLR、PCSK9、HMGCR、CYP7A1。4.化瘀祛痰方对ApoE-/-小鼠肝脏胆固醇代谢相关基因mRNA与miRNA表达的影响mRNA验证结果显示:与空白对照组相比,模型组SREBP2、HMGCR、LDLR、CYP7A1和PCSK9 mRNA表达显著下调(p<0.05,p<0.01);与模型组相比,中药组SREBP2、LDLR、CYP7A1和PCSK9 mRNA表达显著上调(p<0.05,p<0.01),HMGCR变化没有显著意义。miRNA验证结果显示:与空白对照组相比,miR-1933-3p、miR-335-3p、miR-351-5p、miR-485-5p、miR-5114、miR-676-3p、miR-677-5p、miR-7043-3p和miR-7091-3p在模型组中显著上调(p<0.05,p<0.01)与测序结果相一致。与模型组相比,中药组miR-677-5p和miR-7043-3p显著下调(p<0.05)。结论:1.化瘀祛痰方能够有效改善ApoE-/-小鼠血脂紊乱与肝脏脂质沉积。2.胆固醇代谢相关miRNA-mRNA分子网络可能在ApoE-/-小鼠脂代谢紊乱中发挥关键作用。3.化瘀祛痰方可能通过调控PCSK9、SREBP2、LDLR和CYP7A1改善胆固醇稳态失衡,上游机制可能与其调控miR-677-5p和miR-7043-3p有关。
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