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穹宇萤(Pygoluciola 在我国南方多省均有分布,成虫盛发期在7月份,雄萤聚集在垂下的藤蔓或者树叶末端快速闪光以吸引雌虫,雌虫闪光频率相对较慢。雌、雄成虫发光器发光颜色不同,存在光谱性二型现象;其中,雄虫发光器发光颜色偏黄,雌虫发光器发光颜色偏绿。大端黑萤属棘手萤属,成虫个体较大,幼虫陆生,捕食蚂蚁等幼小昆虫,具有自相残杀的习性。大端黑萤同样存在光谱性二型现象:雄虫发光器发光颜色偏黄,雌虫发光器发光颜色偏绿。目前尚未有对萤火虫发光器发光光谱性二型机制的研究报道,本实验首次通过荧光素酶基因克隆、定量分析、蛋白表达等分子生物学技术综合探索萤火虫发光器发光颜色多样性的机制,为探究萤火虫发光器发光光谱性二型提供理论依据。1、通过克隆获得萤火虫荧光素酶基因利用RT-PCR以及RACE技术,我们在发光器发光颜色单一,发光颜色偏黄的边褐端黑萤(Abscondita terminalis)中发现了两种荧光素酶基因(ALuc 1,ALuc2);同时,在具有发光器发光光谱性二型现象的穹宇萤(Pygoluciola qingyu)和大端黑萤(Abscondita anceyi)中也分别发现了两种荧光素酶基因(PqLuc1,PqLuc2;AaLuc1,AaLuc2)。序列比对分析结果显示:AtLuc1,PqLuc1 和 AaLuc1 与之前研究报道的近缘种 Luciolalateralis 的 Luc 1-type firefly luciferase具有很高的相似度;而AtLuc2,PqLuc2和AaLuc2与之前研究发现的近缘种Luciola lateralis的Luc2-type firefly luciferase具有很高的相似度,并且属间保守性高。2、两种荧光素酶基因在不同组织中的定量表达通过Real-time PCR,我们对穹宇萤和大端黑萤不同组织部位的荧光素酶基因的相对表达量进行测定分析。结果显示,在穹宇萤雌、雄成虫发光器中,PqLuc1均显著表达,但在其他组织中表达丰度很低;PqLuc2仅在雌虫成虫卵巢中有表达。此外,大端黑萤也表现出类似结果:AaLuc1在雌、雄虫成虫发光器中均有显著表达,在其他组织中表达丰度很低;AaLuc2仅在雌虫成虫卵巢中有显著表达。3、原核表达荧光素酶基因通过蛋白表达、提取、纯化以及浓缩,获得了 PqLuc1的蛋白序列以及高纯度的蛋白产物。这为之后我们研究pH或其他外界因素对萤火虫发光器发光颜色的调节作用以及发光颜色多样性的机制研究奠定了基础。本次研究证实了:(1)边褐端黑萤、穹宇萤和大端黑萤均具有两种荧光素酶基因;(2)萤火虫发光器发光光谱性二型现象不是由于雌、雄虫中不同荧光素酶基因的分别表达导致的。