前言:　　 创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)专指由外伤引起的脑组织损害,又称颅脑损伤或头部外伤。TBI是世界范围内死亡和致残的主要原因,特别是儿童和青年人。TBI的全球发病率正在增加,特别是在发展中国家。严重的TBI会立即导致神经元和神经胶质细胞受损以及和相关的神经功能障碍,包括认知、情感和行为障碍,致残率高、死亡率高。20世纪在诊断和治疗领域的重大进展已经明显降低了死亡率。这种因TBI引起的死亡率的下降导致了残疾人口数量随之增加,给社会和家庭造成巨大的经济负担和精神负担。对TBI造成的组织损伤后的修复治疗是当前脑研究的热点。　　 研究表明,由创伤后的数分钟至数天内发生的一系列复杂的细胞生物化学过程导致了继发性损伤。这一继发过程可能是治疗失败、并成为在院TBI病人死亡的最主要原因。目前,尚没有任何药物可以阻止继发性损伤的进展。由于神经保护性治疗可以限制。TBI后的损伤程度,停止或减轻继发性损伤,已经受到了极大的关注。然而,临床试验中测试的可能阻止这些细胞损伤机制的方法在很大程度上都失败了。　　 近年来对于神经干细胞(Neuralsterncells,NSCs)或神经前体细胞(neuralprogenitorcells,NPCs)的研究为应用这些细胞治疗脑损伤成为可能,TBI后的功能网络重建已成为干细胞治疗的目的之一。我们前期的研究表明,在选择性的感觉运动功能试验中,NSCs移植治疗大鼠TBI后第1周,就起到了促进功能恢复的作用。尽管目前体内研究表明移植的NSCs会与受损的内源性神经元发生相互作用,但其具体作用机制尚不清楚。有研究认为这种对宿主细胞的保护和解救措施与NSCs释放的某些保护因子或特殊神经介质以及存在于损伤脑组织中的细胞间信号有关,然而,仅凭这一机制尚不足以阐明NSCs在移植中发挥的有利作用。　　 因此,本研究应用改良的Feeney法制备TBI动物模型,NSCs脑内移植后,于不同时间采用免疫组织化学、RT-PCR和免疫印迹等方法检测移植点及其周围脑组织中细胞连接、细胞粘附和生长相关蛋白的表达改变,探讨移植促进组织修复的相关机制,旨在为推广临床应用NSCs移植治疗TBI提供可靠的实验依据。　　 方法:　　 从E14SD大鼠胚胎分离NSCs,进行原代培养及传代培养;用含10%胎牛血清的培养基对NSCs进行诱导分化;采用免疫细胞化学技术对培养的NSCs和其分化为神经元的表型进行鉴定。采用改良的Feeney法制备创伤性脑损伤模型。利用脑立体定位仪和微量注射泵进行NSCs脑内移植。采用免疫组织化学技术、免疫印迹技术和RT-PCR技术检测在移植后不同时间脑组织损伤区缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)、整合素(integrin)的表达。构建真核表达载体pcDNA-BDNF,采用非脂质体的脂类转染试剂转染NSCs,应用免疫荧光双标、激光共聚焦扫描显微镜和RT-PCR技术检测转染细胞BDNF和Nestin的表达和共存。分别将BDNF转染的NSCs(BDNF/NSCs)和天然NSCs移植于TBI动物脑内,比较BDNF/NSCs与NSCs于移植后不同时间点对脑组织损伤区BDNF和生长相关蛋白(grow-associatedprotein43,GAP43)mRNA和蛋白表达的改变。　　 结果:　　 1、在培养基中,NSCs呈球团状悬浮生长,Nestin表达阳性。用含10%胎牛血清的培养基对NSCs进行体外诱导分化,发现分化后第2天,多数细胞伸出突起,以后突起逐渐延长,分支增加。分化后第5d,部分细胞呈βⅢ-微管蛋白阳性。　　 2、免疫组织化学显示,无论有无NSCs移植,在移植后第1、2和4w的受损脑组织中,均可见Cx43在细胞膜上、膜旁的胞浆里及在突起中呈棕黄色表达。NSCs移植大鼠的Cx43染色在各个时间点均显著强于对照组(P＜0.05)。NSCs移植大鼠Cx43的mRNA表达相对值在1、2和4w分别为1.38±0.08,1.69±0.10和1.53±0.09;对照组大鼠Cx43的mRNA表达分别为0.55±0.14、0.91±0.08和0.42±0.07。在移植后的4w内,在NSCs移植组移植点及其周围脑组织中Cx43的mRNA和蛋白表达显著高于对照组(P＜0.01)。　　 3、整合素阳性产物主要表达于细胞膜,呈棕黄色。在对照组及移植组均可见阳性细胞表达。在不同时间点,NSCs移植组整合素阳性细胞均显著多于对照组,同一时间点两组间比较,差异有显著性意义(P＜0.05)。NSCs移植组大鼠移植点及周围脑组织中整合素的mRNA表达相对值在1、2和4w分别为1.7l±0.07,1.92±0.11和1.83±0.08。对照组分别为0.81±0.06、1.25±0.07和1.17±0.09。在NSCs移植组移植点及其周围脑组织中整合素的mRNA表达均显著高于对照组(P＜0.01)。整合素的mRNA表达和蛋白表达结果相一致。　　 4、克隆测序结果显示,重组质粒与参考序列完成一致,pcDNA3.1-BDNF质粒经HindⅢ/EcoRⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳可见749bp和5.4kb两个条带,其大小分别与载体pcDNA3.1和BDNFcDNA一致。转染细胞经药物筛选后第10d,免疫细胞化学染色显示部分细胞呈Nestin及BDNF双重阳性,RT-PCR检测可见转染细胞中BDNF呈高表达(P＜0.01)。　　 5、RT-PCR和免疫印迹检测结果显示,在移植后第1、2w,BDNF/NSCs移植组损伤灶及周围脑组织中的BDNF呈高表达。在移植后的4w内,与NSCs移植组相比,BDNF/NSCs移植组移植点及周围脑组织中GAP43的表达显著增强(P＜0.01)。　　 结论:　　 1、移植NSCs至TBI大鼠损伤脑组织,在移植点周围脑组织中Cx43的表达显著增加。　　 2、移植NSCs至TBI大鼠损伤脑组织,在移植点周围脑组织中整合素的表达显著增加。　　 3、在BDNF/NSCs细胞移植治疗TBI中,BDNF过表达显著上调了GAP43的表达。