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【目的】本研究拟以牛朊蛋白正常基因和其含单个氨基酸突变的3 个变异体基因克隆为实验材料,构建牛朊蛋白基因重组表达质粒pGEX-BoPrP(93～241)、pGEX-BoPrP(93～241)(S154N)、pGEX-BoPrP(93～241)(A129V)和pGEX-BoPrP(93～241)(Q234R)及其各原核表达重组菌,以获得4 种有活性的牛重组朊蛋白,进而为牛朊蛋白基因突变与其蛋白结构和性质变化关系的研究提供实验材料。【方法】应用DNA 重组技术,正确地构建牛朊蛋白基因的1 个正常重组朊蛋白和3 个单氨基酸变异体的原核表达载体,经转化E.coli BL21 (DE3),以获得重组菌E.coli GST-BoPrP (93～241)、GST-BoPrP(93～241)(S154N)、GST-BoPrP(93～241)(A129V)和GST-BoPrP(93～241)(Q234R),在诱导表达优化条件下诱导各重组菌进行表达,裂菌后对所产生的不溶性包涵体用0.1%温和去污剂Triton X-100 和中低浓度尿素进行洗涤提纯,包涵体提纯物经8 mol/L尿素处理,使其溶解变性后对包涵体裂解产物进行透析复性,并对GST-BoPrP(93～241)(Q234R)复性产物进行GSTrap FF 柱层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting 观察其提纯和复性效果。【结果】成功构建了重组菌E.coli GST-BoPrP(93～241)、GST-BoPrP(93～241)(S154N)、GST-BoPrP(93～241)(A129V)和GST-BoPrP(93～241)(Q234R),分别可表达预期分子质量约为42.4 ku的与单抗4C11 发生反应的融合蛋白;在37℃以1 mmol/L IPTG诱导表达6 h的优化条件下,各重组菌可产生表达量占细菌总蛋白量30%～45%的目的蛋白;各重组菌诱导表达后所产生的目的蛋白以包涵体的形式存在于菌体内;裂菌后提纯目的包涵体蛋白,经尿素变性处理和透析复性,获得分子质量约为42.4 ku的与单抗4C11 发生反应的融合蛋白,复性产物具有较高纯度;GST-BoPrP(93～241)(Q234R)复性产物经GSTrap FF 柱层析纯化后,可获分子质量约为42.4 ku 的目的蛋白并具有良好的免疫反应性;对比复性产物与纯化产物,发现GSTrap FF 柱层析可除去复性产物中分子质量约为31～40 ku间的杂蛋白,但出现了分子质量约为26 ku的条带,表明GSTrap FF 柱层析可获得高纯度的目的蛋白。