植物的自交不亲和性反应是一种花柱与花粉间的特异性识别反应,这种机制与动植物对病原微生物的识别和抵御的先天免疫反应相似。目前,在孢子体型自交不亲和性的十字花科植物中已证明了类似免疫识别因子所决定的自交不亲和性反应,但在S-RNase介导的配子体型自交不亲和性反应中尚未见报道。目前,在苹果中发现S-RNase可在ABC转运蛋白的协助下进入花粉管,打破花粉管内钙离子的浓度梯度,但尚未明确苹果S-RNase在进入花粉管过程中钙离子激活了花粉管内的何种信号通路,诱导了哪个防御应答因子的响应,来应对S-RNase的浸入。因此,本研究以苹果为试材,利用多种技术手段证明了 S-RNase在进入花粉管过程中引起了Ca2+-ROS-JA-MdMYC2的一系列信号反应,诱导了花粉管中一个具有γ-硫堇结构域的防御蛋白的响应,防御应答S-RNase进入花粉管,且抑制S-RNase活性。其主要研究结果如下:1.我们从钙信号研究入手,验证了 S-RNase可以打破花粉管内钙离子梯度,且影响钙响应蛋白MdCBL5的表达。对ROS信号检测发现,花粉管尖端的ROS信号减弱,亚顶端的显著增强;qRT-PCR检测发现S-RNase可诱导ROS相关基因 上调表达;此外,我们利用高效液相色谱法检测了添加S-RNase后花粉管JA含量,结果显示:JA明显升高。因此,我们克隆了苹果花粉管中茉莉酸信号途径关键转录因子 基因,qRT-PCR检测发现S-RNase可以诱导MdMYC2转录水平的上调表达。表明S-RNase可诱导Ca2+-ROS-JA-MdMYC2信号反应。2.利用重组MdMYC2蛋白进行Chip-seq后结合苹果基因组比对分析,发现其中一个为本课题组前期利用S2-RNase筛选花粉酵母cDNA文库获得的γ-硫堇蛋白基因MdD1的启动子序列,酵母单杂交实验进一步验证了 MdMYC2与MdD1启动子序列的结合,qRT-PCR检测结果显示MdD1的表达受MdMYC2转录调节,表明MdD1受Ca2+-ROS-JA-MdMYC2信号路径的激活。为了明确MdD1与S-RNase的关系,我们首先利用酵母双杂交、pull-down、双分子荧光互补进一步验证了二者之间存在互作关系。免疫荧光定位结果发现:添加S-RNase后,随着时间的延长,MdD1向花粉管顶端和业顶端膜方向移动,自我和异我花粉管的MdD1均具有响应S-RNase入侵的作用;而沉默MdMYC2,花粉管中MdD1则并未发生位移,说明MdD1通过MdMYC2响应S-RNase的入侵。3.为了明确MdD1是如何作用S-RNase的,我们测定添加MdD1后S-RNase降解rRNA的活性,结果显示MdD1可以抑制S-RNase活性的发挥。将S-RNaes分段后分别与MdD1酵母双杂交实验,结果显示MdD1与S-RNase的活性位点区域互作,与非活性位点区域不互作;酵母双杂交和双分子荧光互补实验发现,定点突变S-RNase的活性位点后,其与MdD1不互作;IP实验在苹果活体内充分证明了未突变的S-RNase可以结合花粉管中的MdD1蛋白,而突变后的S-RNase无法结合花粉管中的MdD 1蛋白。综上所述,苹果花粉MdD1蛋白为花粉管防御应答因子,能被Ca2+-ROS-JA-MdMYC2-MdD1路径激活,响应S-RNase入侵,并抑制其活性。