甘蔗转Cry1C和Cry2A基因研究

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甘蔗是我国重要的糖料作物,由于生长期长,在大田生产过程中易到受杂草的威胁和害虫危害,造成减产减收,选育高抗性品种成为解决这一问题的有效方法。但甘蔗遗传背景十分复杂,常规杂交育种很难将多个优良性状同时集中到一个品系中,而利用植物基因工程手段将外源基因导入甘蔗,培育出高抗性的甘蔗新品种,是一快捷可行的途径。本研究以甘蔗II型胚性愈伤组织为受体材料,采用农杆菌介导法,以bar作为选择标记基因,分别将Cry1C和Cry2A导入甘蔗ROC22和GT21中,经过PPT筛选和PCR检测,初步证实外源基因已成功整合到甘蔗基因组中。本文主要结论如下:1.对甘蔗组织培养技术进行了优化。实验以甘蔗心叶为外植体,使用表面消毒剂75%乙醇消毒蔗梢,并结合将外植体浸泡在含有200mg/L PVP溶液中5min,获得高达90%以上愈伤组织诱导率,比空白对照CK0约高1倍,且愈伤质量好,分化的植株健壮。2.建立了两个甘蔗品种ROC22和GT21的PPT选择压筛选体系。确定ROC22适合的活体叶片涂抹和直接喷施的浓度均为60mg/L PPT,筛选时间为7d;确定ROC22适合的离体叶片浸泡的PPT浓度为30m/L,浸泡5d。确定GT21适合的活体叶片涂抹和直接喷施的浓度PPT均为70mg/L,筛选时间为7d;确定GT21适合的离体叶片浸泡的PPT浓度为40m/L,浸泡5d。3.在苗期对待检的转化植株直接喷施PPT,并结合PPT浸泡离体叶片的方法来筛选转化植株,能有效的降低假阳性的出现,减轻后期分子检测的工作量,提高筛选效率。最后分别通过对筛选标记基因和目的基因进行PCR检测证实,有14株ROC22初步确认导入了Cry1C基因,转化率为5.2%,有17株ROC22初步确认导入了Cry2A基因,转化率为5.8%;有18株GT21初步确认导入了Cry1C基因,转化率为4.7%,有13株GT21初步确认导入了Cry2A基因,转化率为3.9%。
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