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目的基于sH-2Kd-HBc复合物与H-2Kd限制性HBc特异性CTL之间的特异性识别,构建可生物素化sH-2Kd-HBc复合物,进一步制备H-2Kd-HBc四聚体(Tetramer),为深入研究HBV感染过程中特异性CTL应答和效应机制,探索打破慢性HBV感染者免疫耐受状态的方法奠定实验基础。方法以H-2Kd胞外区的克隆质粒为摸板,通过引物接上依赖BirA酶的可生物素化序列(BirA dependent substrate peptide,BSP),将扩增产物装入pET-28(a+)高效表达载体。重组质粒pET-sH-2Kd-BSP和pET-β2M(本室构建)分别转化高效表达菌BL21(DE3)plysS,经IPTG诱导,高效表达目的蛋白,并纯化包涵体中的目的蛋白。将上述过程制备的sH-2Kd-BSP作为重链、β2m作为轻链,与人工合成的H-2Kd限制性九肽(HBc131-139aa)在体外体外采用稀释法进行共折叠复性,然后在BirA酶作用下,对折叠产物进行生物素化,形成了生物素化的H-2Kd-HBc复合物。在这里,利用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的亲和素对折叠复性及生物素化后的复合物进行检测,接着,通过凝胶过滤层析法进一步纯化生物素化的复合物单体。最后,将纯化的生物素化单体与藻红蛋白(phycoerythrin, PE)共孵育形成四聚体,并通过免疫Balb/c小鼠获得HBV特异性CTL,利用构建的四聚体进行检测。结果1、重组载体pET-sH-2Kd-BSP的测序结果经Align软件分析,与GeneBank所公布的序列完全一致。SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,目的蛋白位于细菌的包涵体内,纯化500ml饱和菌液共得到186mg sH-2Kd-BSP和165mgβ2m,纯度都达到70%。2、利用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的亲和素对折叠复性及生物素化后的复合物单体进行检测,证明成功获得了生物素化的sH-2Kd-HBc复合物。3、用HBc真核表达质粒通过不同的途径免疫Balb/c小鼠获得抗原特异性CTL,利用构建的四聚体进行检测,显示我们构建的四聚体能与CTL特异性结合,从功能上证实我结论1、成功地构建了原核表达质粒pET-sH-2Kd-BSP,并在原核表达系统内高效表达,纯化,最后得到的蛋白的浓度和纯度能够满足后续折叠体系的需要。2、重链、轻链及其多肽配体能以适当的比例在体外稀释复性折叠为正确构象sH-2Kd-HBs复合物,在BirA酶作用下进行有效生物素化后,再通过凝胶过滤层析法除去折叠产物中的重链多聚体以及小分子杂质,从而进一步纯化了生物素化的复合物单体。3、通过基因免疫能在小鼠体内诱导较强的特异性T细胞应答,构建的四聚体能与CTL特异性结合,具备检测功能,为进一步探讨细胞免疫应答过程中T细胞识别机制奠定了基础。本研究的意义1、sH-2Kd-HBc复合物作为特异性CTL识别的配体,可用于进一步制备人工抗原提呈细胞(artificial APC)。人工抗原提呈细胞可增强或抑制特异性T细胞克隆的功能状态,为抗原特异性T细胞的过继疗法提供新途径;相应的四聚体可定量检测和分离特异性的T淋巴细胞,为探讨T细胞免疫识别机制奠定了基础。2、本研究所摸索出的技术路线和实验方法还能用于制备其他型别的MHC-多肽复合物及其相应的四聚体。因此,本研究为认识病毒感染、肿瘤发生、移植排斥和自身免疫性疾病的发生机制,以及研究相应的免疫学防治手段奠定了相关实验基础。