USP22是人类基因组编码的54种泛素特异性蛋白酶(Ubiquitinspecific protease)之一,属于去泛素化酶的亚家族,该基因编码525个氨基酸,其中包括氨基末端的UBP锌指结构和羧基末端的USP结构域,是人类SAGA复合体的重要组成部分,它可以通过对组蛋白H2A和H2B的去泛素化作用来调控下游基因的转录,从而调控肿瘤的发生、发展,被认为是癌基因之一,因为USP22与很多肿瘤的发生、发展有密切的关系,它在喉鳞状细胞癌、涎腺腺样囊性癌、涎腺导管癌、大肠癌、宫颈癌中表达明显增加,其过度表达与不良预后和治疗失败密切相关,因此USP22的过度表达可以作为不良预后的标志,而且也可以作为诊断的生物标志物之一。目前关于USP22的研究大多集中在其表达量的变化与肿瘤发生、发展和预后之间的关系,而关于USP22的去泛素化酶活性在肿瘤发生发展中的调控作用的研究很少涉及为了证实USP22去泛素化酶活性在调控肿瘤发生、发展中的作用机制,本研究用si RNA敲除He La细胞中的USP22,证实其可以引起细胞周期阻滞,而这种调控作用主要依赖于其去泛素化酶活性。第一部分:在Hela细胞中用si RNA沉默泛素特异性蛋白酶USP22基因对细胞周期和凋亡的影响目的USP22可以调节肿瘤的发生、复发、远处转移、治疗抵抗及不良预后,而这些作用主要是通过一些细胞信号通路来完成的。虽然目前已经证实USP22与很多肿瘤相关,但其与宫颈癌之间的关系还知之甚少,因此,本研究选择宫颈癌细胞中的He La细胞作用研究对象,观察USP22对He La细胞凋亡和细胞周期的调控作用,从而为宫颈癌的治疗提供帮助。方法1设计针对USP22基因的特异性si RNA序列,将其转染到He La细胞中,分别在24小时、48小时、72小时后收集细胞。提取细胞中的RNA及总蛋白,用荧光定量PCR检测USP22基因在各组的分布情况,验证沉默效果及最佳沉默时间,用Western blot检测USP22蛋白在各组的分布,验证沉默效果及最佳沉默时间。2检测沉默USP22基因对He La细胞凋亡的影响:将USP22 si RNA及对照si RNA分别转染至He La细胞中,72小时后收集细胞,用流式细胞术检测各组的细胞凋亡和细胞周期的分布情况。3检测沉默USP22基因对细胞周期相关的一些因子的影响:将USP22si RNA及对照si RNA分别转染至He La细胞中,72小时后收集细胞,提取RNA,然后用q RT-PCR的方法检测BMI-1,c-Myc,cyclin D2及p53的表达情况。结果1 USP22 si RNA对USP22基因表达的影响:He La细胞在转染三种USP22 si RNA及对照si RNA片段72小时后,USP22 si RNA组的m RNA水平上基因表达均明显下调(P<0.05)。USP22 si RNA-1效果最明显,72小时沉默效果最好。2沉默USP22基因对He La细胞凋亡和细胞周期的影响:本研究用流式细胞术检测USP22与细胞凋亡之间的关系,在分别转染USP22si RNA及对照si RNA至He La细胞中,72小时后收集细胞。流式细胞检测结果显示:转染对照si RNA组凋亡率为4.41%±0.58%,转染USP22si RNA组凋亡率为4.27%±0.64%,两组之间无统计学差异。因此说明,USP22对He La细胞的凋亡不产生影响。转染对照si RNA组G1期的细胞含量为59.1%±3.47%,转染USP22 si RNA组凋亡率为73.4%±4.39%,两组之间的差别有统计学意义,沉默USP22后使G1期细胞数增加了14.3%,说明USP22表达水平的下降可以引起He La细胞细胞周期阻滞,使其停留在G1期,从而可以抑制细胞的增殖。3检测USP22调控He La细胞周期的机制:敲除USP22后,BMI-1,c-Myc,cyclin D2的表达水平和对照组相比有下降趋势,差异有统计学意义,说明BMI-1,c-Myc,cyclin D2是USP22调控He La细胞周期过程中的正向调节因子。而p53表达水平在敲除USP22后呈现上升的趋势,和对照组相比差异有统计学意义,说明p53是USP22调控He La细胞周期过程中的负向调节因子。因此,以上的结果说明USP22可以通过调节细胞周期来调节He La细胞的增殖,这一作用可能是通过cMyc/cyclin D2,BMI-1和p53的途径来实现的。结论1 USP22 si RNA-1沉默效果最佳,最佳沉默时间为72小时。2流式细胞术检测结果说明,USP22对He La细胞的凋亡不产生影响,USP22表达水平的下降可以引起He La细胞细胞周期阻滞,使其停留在G1期,从而可以抑制细胞的增殖。3 USP22可以通过调节细胞周期来调节He La细胞的增殖,这一作用可能是通过c-Myc/cyclin D2,BMI-1和p53的途径来实现的。第二部分:泛素特异性蛋白酶USP22的去泛素化酶活性对其调控He La细胞周期作用的影响目的前面的研究证实USP22可以调节He La细胞的细胞周期,但这一作用是否与USP22的去泛素化酶活性之间相关尚不清楚,为了进一步探讨USP22酶活性与这一调节作用之间的关系,本部分拟构建失活突变体USP22(C185S),采用本研究室建立的以Ub-Met-β-gal和p GEX-Ub52为底物的去泛素化酶活性检测体系检测USP22(C185S)的酶活性的变化,并检验USP22失活之后对He La细胞细胞周期的影响,以便进一步了解USP22在宫颈癌发生发展中的作用及机制,从而为宫颈癌的治疗寻找新的治疗靶点奠定分子理论基础。方法1 p GEX-USP22质粒和p AC-T7-USP22质粒的构建:采用pc DNA3.1-V5-FLAG-HUSP22质粒为模板,用双酶切的方法将USP22切下,并连接至p GEX-6P-1中,构建p GEX-USP22质粒。然后以p GEX-USP22为模版,用双酶切的方法将USP22切下并连接至p AC-T7中,构建p AC-T7-USP22质粒。2 p GEX-USP22(C185S)突变质粒和p AC-T7-USP22(C185S)的构建:采用本室保存的p GEX-USP22(WT)质粒为模板,定点突变C185S位点,构建人的p GEX-USP22(C185S)突变质粒。然后以p GEX-USP22(C185S)突变质粒为模版,将USP22用双酶切的方法切下并连接至p AC-T7质粒中,构建p AC-T7-USP22(C185S)。3采用GST-Ub52模型底物和Ub-Met-β-gal模型底物对野生型USP22(WT)和失活突变体USP22(C185S)进行去泛素化酶活性分析,Odyssey双色红外激光成像系统扫描。4检测沉默USP22基因对He La细胞凋亡及细胞周期相关因子的影响:将USP22(WT)及USP22(C185S)分别转染至He La细胞中,72小时后收集细胞,用流式细胞仪检测各组的细胞凋亡、细胞周期的分布情况。用q RT-PCR的方法检测BMI-1,c-Myc,cyclin D2及p53的表达情况。结果1野生型USP22及失活突变体USP22(C185S)质粒的构建:测序结果证实p GEX-6P-1和p AC-T7中成功插入了USP22及失活突变体USP22(C185S)序列,证明换载和突变成功。2 p GEX-USP22(C185S)和p AC-T7-USP22(C185S)对酶活性的影响:USP22(C185S)突变作用于模型底物GST-Ub52时不能去泛素化GST-Ub52,而野生型USP22则可以产生分子量约36KDa的产物。UbMet-β-gal模型底物去泛素化酶活性分析的结果与GST-Ub52法一致,说明USP22(C185S)突变体失去了去泛素化酶活性。3检测USP22去泛素化酶活性对He La细胞凋亡的影响:将p EGFPC1、p EGFP-USP22(WT)和p EGFP-USP22(C185S)分别转染至He La细胞中,流式细胞检测结果显示三组之间无统计学差异,说明USP22的去泛素化酶活性对He La细胞的凋亡不产生影响。4 USP22去泛素化酶活性对He La细胞周期的影响:用流式细胞术检测USP22与细胞周期之间的关系,转染对照p EGFP-C1组和转染p EGFP-USP22(WT)组之间比较差异有统计学差异,转染对照p EGFPC1组和转染p EGFP-USP22(C185S)组之间比较差异无统计学意义。说USP22对He La细胞周期的调控是依赖于其去泛素化酶活性的,当酶活性消失后调控作用即消失。5检测USP22去泛素化酶活性对细胞周期相关的一些因子的影响:USP22(WT)可以上调BMI-1,c-Myc,cyclin D2的表达水平,下调p53表达水平。而转染p EGFP-USP22(C185S)组,这四个因子的水平与转染对照p EGFP-C1组没有明显差别,说明USP22对BMI-1,c-Myc,cyclin和p53的调控作用也是依赖于其去泛素化酶活性的。结论1 USP22的活性与其调控He La细胞的细胞周期相关,USP22在失去活性后,对He La细胞的细胞周期就失去其调节功能。2 USP22在失去活性后对细胞周期相关的因子p53,BMI-1,cMyc,cyclin D2也不具有调节作用。第三部分:泛素特异性蛋白酶USP22基因错义突变对去泛素化酶活性的目的前面的研究证实USP22可以调节He La细胞的细胞周期,而这一调节作用与USP22的去泛素化酶活性密切相关。目前对于USP22的单核苷酸多态性对其活性的影响还知之甚少,因此将在NCBI上检索到的4个错义突变作为研究对象,研究这四个突变体对去泛素化酶活性的影响,并选择有活性变化的突变体转染至He La细胞,观察其对细胞周期的调节作用,以便进一步了解USP22在宫颈癌发生发展中的作用及机制。方法1 USP22(R98W),USP22(N283S),USP22(P290L)和USP22(Y513C)突变质粒的构建:采用本室保存的p GEX-USP22(WT)质粒为模板,定点突变R98W,N283S,P290L和Y513C位点,构建人的p GEX-USP22(R98W),p GEX-USP22(N283S),p GEX-USP22(P290L)和p GEX-USP22(Y513C)突变质粒和p AC-T7-USP22(R98W),p AC-T7-USP22(N283S),p AC-T7-USP22(P290L)和p ACT7-USP22(Y513C)质粒。2去泛素化酶活性检测:采用GST-Ub52模型底物和Ub-Met-β-gal模型底物对四个突变体进行去泛素化酶活性分析,Odyssey双色红外激光成像系统扫描。3检测USP22(Y513C)对He La细胞凋亡的影响:将USP22(Y513C)转染至He La细胞中,用流式细胞术检测各组的细胞凋亡情况及细胞周期的分布情况。4检测USP22(Y513C)对细胞周期相关的一些因子的影响:将USP22(Y513C)转染至He La细胞中,然后用q RT-PCR的方法检测BMI-1,c-Myc,cyclin D2及p53的表达情况。结果1构建USP22(R98W),USP22(N283S),USP22(P290L)和USP22(Y513C)突变质粒:测序结果证实p GEX-6P-1和p AC-T7中成功插入了USP22(R98W),USP22(N283S),USP22(P290L)和USP22(Y513C)序列,证明突变和换载成功。2检测USP22(R98W),USP22(N283S),USP22(P290L)和USP22(Y513C)对酶活性的影响:USP22(R98W),USP22(N283S),USP22(P290L)突变作用于模型底物GST-Ub52和Ub-Met-β-gal模型底物的去泛素化酶活性分析的结果与野生型USP22差异无统计学意义,USP22(Y513C)的去泛素化酶活性分析的结果与野生型USP22相比显著下降,在Ub-Met-β-gal模型底物活性检测体系中USP22(Y513C)完全失去了去泛素化酶活性,在GST-Ub52模型底物活性检测体系中,USP22(Y513C)的活性也明显下降,下降至野生型USP22的1.7%。3 USP22(Y513C)对He La细胞凋亡的影响:将p EGFP-C1、p GEXUSP22(WT)、p GEX-USP22(C185S)和p GEX-USP22(Y513C)分别转染至He La细胞中,流式细胞检测结果显示四组之间差异无统计学差异。USP22(Y513C)去泛素化酶活性的下降使其调控He La细胞周期的功能消失,也就进一步说明USP22对He La细胞周期的调控是依赖于其去泛素化酶活性的。4 USP22(Y513C)对细胞周期相关的一些因子的影响:转染p EGFP-USP22(Y513C)组中,这四个因子的水平与转染对照p EGFPC1组没有明显差别,进一步说明USP22对BMI-1,c-Myc,cyclin D2和p53的调控作用是依赖于其去泛素化酶活性的。结论1成功构建了USP22的四个错义突变体:USP22(R98W),USP22(N283S),USP22(P290L)和USP22(Y513C)。2四个错义突变体中仅USP22(Y513C)变化明显,其活性显著下降。3 USP22(Y513C)调控He La细胞周期的功能消失,其对BMI-1,c-Myc,cyclin D2和p53的调控作用也消失。