背景与目的:甲胎蛋白（AFP）阴性肝癌是目前肝癌诊断中的主要问题,建立敏感而特异的AFP阴性肝癌诊断新方法非常必要。蛋白质组学技术的发展和应用,发现了不少新的AFP阴性肝癌标志物,但临床鲜有应用。适配子是生物分子的人工核酸配体,通过体外技术 SELEX（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment）筛选而获得,其功能类似抗体,但具有热稳定性、制备简单等优势,在分子检测和肿瘤标志物的发现中具有重要价值。在前期工作中,我们以肝癌血清为靶标,成功筛选出一批肝癌血清适配子,通过捕获和分析适配子的靶蛋白初步发现了肝癌血清标志物。本研究将利用前期技术优势,联合使用适配子及蛋白质谱分析技术,专注于筛选并优选出高特异性AFP阴性肝癌血清适配子,评价其对AFP阴性肝癌的诊断价值,采用磁珠技术捕获特异性适配子的血清靶蛋白并进行蛋白组学分析,为建立AFP阴性肝癌诊断新方法奠定基础。方法:1、收集血清标本:收集2011～2015年间在南昌大学第一附属医院住院治疗前的部分AFP阴性肝癌、AFP阳性肝癌、肝硬化、慢性肝炎患者的血清标本及其相关临床及实验室资料,并同期收集检查结果未见异常的健康体检者的血清标本及资料。2、制备AFP阴性肝癌血清适配子筛选的初始文库:以长时间冻存的前期肝癌血清适配子最后一轮SELEX筛选后制备的随机单链寡核酸（ssDNA）亚文库作为AFP阴性肝癌血清适配子筛选的初始文库,在对称和不对称PCR扩增分析确认亚文库完好的基础上,对文库进行不对称PCR扩增并切胶回收ssDNA,制备出AFP阴性肝癌血清适配子SELEX筛选的初始文库。3、筛选AFP阴性肝癌血清适配子:（1）制备靶血清:选择10例AFP阴性肝癌患者的术前血清和10例肝硬化患者的血清,分别等量混合制备成AFP阴性肝癌混合血清和肝硬化混合血清（消除个体间的异质性）,用作SELEX筛选的靶血清。（2）正向SELEX筛选:将AFP阴性肝癌混合血清与文库孵育,然后进行12%中性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离及GelRed染色,切胶回收和纯化结合ssDNA,单引物限制性扩增法制备亚文库,进行下一轮SELEX筛选。连续两轮正向SELEX筛选后的亚文库与AFP阴性肝癌血清的结合带无明显增强时终止正向筛选。（3）消减SELEX筛选:将最后一轮正向筛选后制备的亚文库与肝硬化混合血清孵育,然后进行12%PAGE分离及GelRed染色,切胶回收和纯化非结合ssDNA,单引物限制性扩增法制备亚文库,进行下一轮消减SELEX筛选。亚文库与肝硬化血清结合无明显减弱时终止消减SELEX筛选。4、适配子的分离及其结构分析:以筛选后回收的ssDNA为模板进行对称PCR扩增,送生物公司克隆分离核酸片段并测序。长度和两端固定序列与文库吻合的核酸片段即为适配子。采用RNA Structure 4.6软件进行适配子的二级结构模拟分析。5、适配子的特异性分析:人工合成适配子,先将其与AFP阴性肝癌混合血清和正常混合血清孵育、12%中性PAGE分离和GelRed染色,观察适配子对AFP阴性肝癌混合血清的特异性,对上述初步鉴定有特异性的适配子再与AFP阴性肝癌血清和非肝癌血清（肝硬化、肝炎和正常）单个血清标本的验证,进一步观察适配子对AFP阴性肝癌血清的特异性。6、适配子的诊断价值评价:采用前期建立的适配子-血清三重荧光分析法将部分特异性好的适配子与小样本AFP阴性肝癌和肝硬化血清标本（各32例）进行孵育和测定荧光值,受试者工作特征曲线下面积（AUC）评价适配子对AFP阴性肝癌的诊断价值,AUC最大者为各个适配子的最佳诊断实验条件,诊断价值大的适配子再以最佳实验条件与大样本AFP阴性肝癌、AFP阳性肝癌、肝硬化、慢性肝炎和正常血清标本孵育和荧光测定,评价它们对AFP阴性肝癌的诊断价值。7、AFP阴性肝癌血清适配子靶蛋白的捕获和蛋白组学分析:以大样本评价对AFP阴性肝癌诊断价值大的适配子为捕获分子,采用本课题组前期建立的磁珠分离技术捕获其在AFP阴性肝癌混合血清中的靶蛋白,冻干浓缩后送生物公司进行蛋白组学分析。同时以肝硬化混合血清、慢性肝炎混合血清和正常混合血清为对照。结果:1、前期亚文库完好性鉴定和筛选初始文库制备:长期冻存的前期亚文库完好,成功制备出AFP阴性肝癌血清适配子筛选的初始文库。2、AFP阴性肝癌血清适配子筛选与分离:以AFP阴性肝癌混合血清为靶标进行了 6轮正向SELEX筛选,亚文库与靶血清结合程度明显增强;以肝硬化混合血清为靶标进行3轮消减SELEX筛选后,亚文库与肝硬化血清结合程度有所减弱;从第6正向筛选和第2轮消减筛选后制备的亚文库中克隆分离出120条不同的核酸序列,即成功筛选到120个AFP阴性肝癌血清适配子。模拟分析显示适配子的二级结构丰富多样,有口袋形、发卡形、棒形和球拍形等,提示适配子可能针对AFP阴性肝癌血清中的不同靶标。3、适配子的特异性分析:PAGE胶分析显示部分适配子与AFP阴性肝癌混合血清和单个血清的结合带强于非肝癌血清组,提示部分适配子特异性良好。4、适配子的诊断价值分析:小样本荧光法分析显示16个适配子的最佳检测条件各不相同,在最佳检测条件下16个适配子对AFP阴性肝癌有良好的诊断价值,单项指标的ROC曲线下面积（AUC）达0.724～0.897,3个指标建模的AUC达到0.838～0.935。选择诊断价值最好的3个适配子（AP-ANHC-6-2-33、AP-ANHC-6-1-26和AP-ANHC-6-2-20）进行大样本分析,显示对AFP阴性肝癌仍有良好的诊断价值,单项指标的AUC达到0.713～0.902,多指标建模的AUC达0.863～0.933,尤其是3个适配子联合检测效果优秀,AUC均在0.95以上,诊断AFP阴性肝癌和全部非肝癌的敏感度、特异度和准确度均在90%以上。提示3个适配子之间有互补作用,可能结合不同的靶标或靶标的不同部位。5、AFP阴性肝癌血清适配子的靶蛋白捕获与蛋白组学分析:以上述3个诊断价值良好的适配子为捕获分子进行血清靶蛋白捕获和质谱分析,结果显示适配子 AP-ANHC-6-2-33、AP-ANHC-6-1-26 和适配子 AP-ANHC-6-2-20捕获到 21个、21个和3个只存在AFP阴性肝癌血清的靶蛋白。据文献报道,这些靶蛋白绝大部分与肿瘤相关。蛋白组学理论分析显示,所捕获蛋白主要是细胞外功能蛋白,以结合蛋白为主,主要与蛋白质的转录后修饰、蛋白质更新和分子伴侣相关,提示AFP阴性肝癌血清适配子的靶蛋白主要是具有分子结合功能的胞外蛋白。结论:1、通过血清靶标的正向和消减SELEX筛选,克隆分离出120个AFP阴性肝癌血清适配子,各适配子的二级模拟结构丰富多样,所分析的部分适配子对AFP阴性肝癌具有良好的特异性,表明成功筛选到一批AFP阴性肝癌血清适配子。2、大样本临床血清标本分析证实其中3个适配子对AFP阴性肝癌（包括AFP阴性小肝癌）具有良好的诊断价值,特别是3个适配子联合检测,诊断效果优秀,表明成功筛选到一组具有良好诊断价值的AFP阴性肝癌血清适配子。3、以适配子为捕获分子成功捕获到血清靶蛋白,通过质谱分析发现了 45个只存在于AFP阴性肝癌血清中的靶蛋白,蛋白组学分析显示它们主要是具有分子结合功能的胞外蛋白,且绝大部分与肿瘤相关,提示其中可能存在潜在的AFP阴性肝癌血清标志物。4、SELEX筛选过程中制备的亚文库冻存18个月后仍然完好,可通过PCR扩增来制备适配子SELEX筛选的新文库,表明单链寡核苷酸文库性能稳定,可较长时间冷冻保存。