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研究目的Rap1是小分子G蛋白Ras家族成员之一,体外的实验已经证明Rap1在细胞内发挥多种作用。Rap1对内皮细胞的作用主要是参与对内皮细胞间粘连形成、通透性等功能的调节。最近的研究表明,在内皮细胞中,Rap1不仅仅局限于细胞粘连,而且可以调节内皮细胞对一些促进血管新生刺激因素的反应。换句话说,Rap1在体内可以作为一种正性血管新生调节因素。Rap1GAP是小分子G蛋白Rap1的GTP酶激活蛋白,它可以加速Rap1由与GTP结合的活化形式转变为与GDP结合的去活化形式的过程。一些研究者发现Rap1GAP可以失活Rap1,抑制Rap1介导的血管新生。但也有一些实验结果并不支持这一结论。因此,很有必要进一步研究Rap1GAP在血管新生的作用。揭示Rap1GAP在血管新生的作用有利于进一步了解血管新生的机理,并且能为与血管新生相关疾病提供一个新的、特异的研究切入点。血管新生是微血管从已经存在的血管床以出芽的方式长出,并逐渐形成新的血管分支及毛细血管丛的过程,它由一系列相互协调密切配合的过程来组成的,许多因素参与了对其的调节。PI3K/Akt和ERK信号通路广泛参与细胞的有丝分裂、代谢运动、生存、凋亡和分化等过程。其在血管新生中的作用也越来越受到重视。所以,我们设想Rap1GAP是通过PI3K/Akt和ERK信号通路来实现其在血管新生中的作用。本研究的目的就在于研究Rap1GAP在血管新生中的作用机理。研究方法首先通过人脐静脉获得内皮细胞后对其培养、扩增。利用Fugene 6转染脐静脉内皮细胞,使其高表达Rap1GAP。然后通过BrdU-ELISA方法检测转染Rap1GAP后,内皮细胞增殖变化情况,利用Transwell小室测定内皮细胞的迁移能力,通过体外管腔形成实验检测微血管样结构的形成情况。为了研究Rap1GAP对内皮细胞发挥作用的机理及信号传导通路,通过免疫印迹的方法检测内皮细胞转染Rap1GAP后ERK, Akt磷酸化的变化情况。同时进一步观察ERK和Akt信号传导通路特异拮抗剂对内皮细胞细胞增殖、迁移的影响。最后,对转染有Rap1GAP的HUVECs给予外源性VEGF刺激后观察其增殖、Cyclin D1以及ERK、Akt磷酸化的变化情况,从而研究Rap1GAP对VEGF促进内皮细胞增殖是否影响及作用机制。实验结果1高表达的Rap1GAP能够抑制内皮细胞的增殖、迁移和体外管腔形成能力。2 Rap1GAP能够抑制Rap1/Akt和Rap1/ERK信号通路,进而抑制内皮细胞的增殖、迁移.3 Rap1GAP高表达有抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖的效应,可能是通过Rap1/ERK和Rap1/Akt通路抑制细胞周期来实现对此效应的调节。实验结论Rap1GAP能够抑制内皮细胞的增殖、迁移,通过Akt和ERK信号通路来发挥该作用。