背景:SIRT6（silent mating type information regulation 2 homolog 6）具有单ADP-核糖基转移酶活性以及去乙酰化酶活性,在调节基因组稳定性,细胞代谢,应激反应和衰老过程中起着重要的作用。其中,SIRT6在作为去乙酰化酶时,可以对多种蛋白底物包括组蛋白及非组蛋白进行去乙酰化修饰,例如SIRT6可以使H3K9ac去乙酰化。同时,SIRT6还可以抑制NF-κB和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）靶基因的转录。还有研究显示SIRT6能够决定干细胞及神经干细胞分化的方向。同时SIRT6与脑内神经细胞的发育也密切相关。研究表明,在成年海马中过表达SIRT6的小鼠会其未成熟神经元的数量增加以及成熟神经元数量的减少,但是不会影响神经胶质细胞的分化产生,这提示我们SIRT6可能参与了海马内的神经元分化和成熟,另外在海马发育过程中,SIRT6还可能作为细胞命运的调节因子来发挥功能。综合以上研究,我们发现SIRT6与大脑的各个功能密切相关,特别是可以影响神经元的分化和成熟过程,然而SIRT6是如何发挥这个功能还尚不得知。NeuroD6（Neurogenic Differentiation 6）,也称为Nex1,含有bHLH（basic helix-loop-helix）DNA结合域,所以它作为神经特异性转录因子可以结合基因的上游启动子E-box序列（CANNTG）,促进相关下游基因的表达。研究发现NeuroD6基因的表达与神经元分化和突触发生过程平行进行。同时,上游含有E-box区域的BDNF（Brain-derived neurotrophic Factor）,是已知体内含量最多的神经营养因子,它可以通过与它的受体酪氨酸激酶B（TrkB,tyrosine kinase B）结合,再激活下游一系列信号通路,实现增加突触可塑性以及促进神经发育的功能。本研究探索二者NeuroD6和SIRT6的关系,为通过SIRT6来调节神经元分化提供了新的见解。目的:因此本实验的目的就是,在前期已经鉴定出SIRT6与NeuroD6存在一定相互作用的基础上,进一步验证探索二者的关系。首先检测SIRT6是否可以与NeuroD6进行结合并且调控其乙酰化水平。接着鉴定NeuroD6是否可以调节脑源性神经营养因子BDNF表达。最后通过一系列的实验检测SIRT6是否可以通过调控NeuroD6的乙酰化对BDNF表达水平进行调控以及对神经元突起生长是否有一定的影响。方法:（1）我们首先利用免疫荧光染色技术验证SIRT6和NeuroD6在细胞内的定位,再采用核质分离法,用WesternBlot检测二者分别在胞核、胞质的含量。并进行Co-IP实验以检测,SIRT6和NeuroD6是否结合在一起。同时构建Flag标签载体,进行IP实验再次检测SIRT6与NeuroD6的相互作用。最后构建体外表达质粒后,诱导表达后洗脱纯化再进行孵育,利用pulldown实验验证二者在体外是否仍存在相互作用。（2）接着通过利用Ch-IP实验来验证NeuroD6作为一个转录因子,是否可以结合BDNF的E-box区以促进其表达。改变NeuroD6的含量,检测与BDNF的E-box区结合能力是否下降。与此同时,构建包含BDNF启动子区的生物素探针,利用DNA-pulldown实验反向拉取NeuroD6,检测二者的结合能力。（3）验证NeuroD6对BDNF有促进转录的功能后,再进行SIRT6对BDNF调控的功能性探究。构建SIRT6的突变体质粒,以及包装表达SIRT6-shRNA的慢病毒,利用萤光素酶报告基因检测法,验证NeuroD6乙酰化水平是否影响BDNF的启动子区表达活性。（4）最后,在SIRT6对NeuroD6去乙酰化修饰的基础上,确定SIRT6是否可以对神经元突起的生长具有一定的调控作用。培养原代小鼠皮层神经元,分别转染空载体,SIRT6过表达载体以及SIRT6突变体,用Western Blot检测NeuroD6的乙酰化水平。同时进行免疫荧光染色,研究SIRT6对神经元突起生长的影响。结果:（1）我们通过免疫荧光染色技术找到NeuroD6和SIRT6在细胞内的定位,再采用核质分离法,用WesternBlot检测二者分别在胞核、胞质的含量。发现NeuroD6和SIRT6均在细胞核内大量表达,并且染色结果表明二者有重叠部分。Co-IP实验证实SIRT6和NeuroD6结合在一起。构建Flag-SIRT6载体,进行IP实验发现NeuroD6蛋白被Flag拉出。构建体外表达质粒后,诱导表达后洗脱纯化再进行孵育,利用pulldown实验验证二者在体外存在相互作用,NeuroD6的N端与SIRT6结合。（2）利用Ch-IP实验来验证NeuroD6作为一个转录因子可以结合BDNF的E-box区和增强子区来促进BDNF的表达。在降低NeuroD6的含量的情况下,所结合的 BDNF的启动子区以及增强子区的含量也随之下降。与此同时,DNA-pulldown实验反向可以拉取NeuroD6,二者在其启动子区存在大量结合。（3）利用萤光素酶报告基因检测法,降低SIRT6的酶活性,下游BDNF启动子区的表达活性也随之降低。并且减少SIRT6的含量,也使得萤光强度下调,说明NeuroD6结合BDNF启动子区能力也随之下降。（4）最后,用编码SIRT6和SIRT6突变体的体以及空质粒转染培养原代神经元,我们利用Western Blot发现,和对照组相比,过表达SIRT6,NeuroD6的乙酰化水平随之降低,神经元突起的复杂性增加。但在突变SIRT6后,和对照组相比,NeuroD6的乙酰化水平没有明显变化,神经元突起复杂性也没有变化。结论:本文通过以上实验结果,发现SIRT6与NeuroD6进行结合并互相作用,并且可以通过调节NeuroD6的乙酰化水平,来改变NeuroD6结合下游BDNF启动子的能力,在一定程度上可能通过去乙酰化NeuroD6来调节神经元突起的生长。