冠状病毒是人类和动物的重要致病原,有的冠状病毒对人类和动物的危害还非常严重。猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新出现的猪肠道冠状病毒,于2011年首次从猪粪便中发现;2014年,PDCoV从美国腹泻猪群中检测并分离到,临床和动物感染实验均发现PDCoV可引起猪只精神沉郁、呕吐、急性水样腹泻、脱水甚至死亡等症状。流行病学调查表明,PDCoV是当前腹泻仔猪中主要的病毒性病原,给国内外养猪业造成了较大的经济损失。本研究利用RNA-Seq技术测定了PDCoV感染IPEC-J2细胞的转录组学,分析不同感染时间中转录水平显著的差异基因,并对感染中差异表达的免疫相关分子及细胞自噬对病毒复制的影响进行了研究,对阐明PDCoV的致病机制及感染后细胞的免疫相关路径解析提供了大量的基础信息和重要的线索。本研究的主要结果如下:1.本研究通过RNA测序(RNA-Seq)技术分析了PDCoV感染IPEC-J2细胞6、24、48h后引起的转录水平变化。结果表明,PDCoV感染IPEC-J2细胞6h、24h及48h时细胞内显著差异表达的基因(differentially expression genes,DEGs)分别为38个(上调23个,下调15个)、210个(上调122个,下调88个)、595个(上调422个,下调173个)。GO富集分析结果表明,DEGs主要在细胞因子、生长因子活性、细胞因子受体结合和生长因子与受体结合等功能显著富集。KEGG富集显示,PDCoV感染影响了固有免疫相关途径,显著上调的DEGs主要富集于NOD样受体、Toll样受体和RIG-Ⅰ样受体信号通路以及JAK-STAT、NF-κB信号通路等常见天然抗病毒免疫信号通路,其中细胞-细胞因子相互作用的pathway差异富集最显著。各种细胞因子的表达因PDCoV感染而显著上调,其中包括趋化因子CXCL10、炎性因子TNF、IL6以及ISG15、MX2、OSA1在内的抗病毒因子等,说明PDCoV感染激活了宿主抗病毒免疫和炎性反应,造成肠道炎症损伤。2.探究了PDCoV感染IPEC-J2细胞过程中所产生的细胞因子在感染中的作用。分别构建了稳定过表达MX2、BST2、ISG15、RSAD2、IL6、RND1基因以及干扰BST2基因的LLC-PK1重组细胞系。利用RT-qPCR和Western-blot分别检测PDCoV感染重组IPEC-J2细胞系中PDCoV N基因转录和蛋白表达水平。结果显示干扰素诱导的MX2、BST2、ISG15、RSAD2蛋白、趋化因子CXCL10和RND1蛋白对PDCoV的复制具有不同程度的抑制作用,但过表达白细胞介素IL6以及干扰BST2后促进PDCoV的复制。3.探究了PDCoV感染诱导的PK1和IPEC-J2细胞自噬机制。细胞自噬是一种细胞内降解过程,可维持细胞的代谢平衡和体内稳态。之前的研究表明PDCoV感染能引起细胞自噬,但不知其具体机制。本研究通过构建表达PDCoV结构蛋白N、M、E和非结构蛋白Nsp6的PK1细胞重组细胞系来研究PDCoV引起细胞自噬的相关分子机制。结果显示,PDCoV结构蛋白N和非结构蛋白Nsp6均可显著上调自噬相关基因LC3-Ⅱ的表达,而使用雷帕霉素诱导的LLC-PK1细胞和IPEC-J2细胞的自噬均促进PDCoV N蛋白表达水平显著上升,使用氯喹抑制自噬后PDCoV N蛋白表达水平显著下调。说明PDCoV N蛋白和Nsp6蛋白能引起细胞自噬,且病毒诱导的细胞自噬有利于PDCoV的复制。综上所述,本研究分析了PDCoV感染的IPEC-J2细胞的转录组变化,发现PDCoV感染导致细胞大量基因表达水平的改变,诱导宿主细胞激活多种抗病毒免疫通路,产生MX2、BST2、ISG15、RSAD2、CXCL10和RND1等免疫相关蛋白,从而抑制PDCoV的复制,进入抗病毒状态;PDCoV N蛋白和Nsp6蛋白能诱导感染细胞自噬,从而有利于PDCoV自身的复制。本研究从转录组学、免疫相关路径及自噬水平揭示了PDCoV的感染机制,为抗PDCoV提供了基础,也可能为其它冠状病毒的抗感染的基础与应用研究提供借鉴。