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研究背景与目的慢性炎症部位易发生肿瘤，约20%的肿瘤发生与慢性炎症有关，有许多癌症患者多数有慢性炎症史，当炎症迁延，癌症的发生率增加。流行病学及分子生物学研究均证明炎症和肿瘤存在着联系。从流行病学的角度分析，慢性炎症患者更容易继发各种肿瘤，大约15％～20％的肿瘤患者都存在潜在的炎症。近年来科学家们对肿瘤炎症微环境的关注越来越多，在肿瘤形成过程中，炎症细胞通过分泌各种炎症因子促进肿瘤细胞生长，产生有利于肿瘤细胞生长的微环境，促使正常细胞发生基因突变，促进血管生成。在肿瘤微环境中，炎症细胞、炎症趋化因子、细胞因子等对肿瘤细胞的生长、转移、分化等起到一定的调节作用，肿瘤微环境在肿瘤的发生及发展过程中扮演着重要角色。TNF-α（肿瘤坏死因子）,是一个关键的促炎细胞因子,其在这一过程中起着重要作用。研究TNF-α对癌细胞凋亡的影响及机制，并深入探讨其对核转录因子NF-κB的活化对癌细胞凋亡的影响，以期可以更确切的阐述炎症介质TNF-α在癌细胞发生发展中的作用。近些年关于天然蛋白酶体抑制剂的报道较多，其通过抑制蛋白酶体的活性干扰和影响细胞原有的功能。天然蛋白酶体抑制剂Withaferin(WA)醉茄素和Celastrol雷公藤红素对炎症和肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用，其抗炎和抑制肿瘤生长的机制成为研究的热点。值得注意的是WA醉茄素和Celastrol雷公藤红素的这些抑制活性机制包括但不局限于其抑制蛋白酶体活性的机制。我们课题主要研究的是TNF-α与这两种天然药物的结合对体外癌细胞的影响。就目前我们的研究结果显示：TNF-α与WA或Celastrol联合使用时可以抑制TNF-α诱导的NF-κB通路的激活，进而抑制了NF-κB下游基因XIAP的表达，间接的WA/Celastrol解除了XIAP对MDA-MB-231乳腺癌细胞中的caspase-3和9的抑制即上调caspase-3和9的活性最终增敏了TNF-α对肿瘤细胞的杀伤作用，促进肿瘤细胞凋亡。这一系列的生物化学反应与WA/Celastrol对蛋白酶体的抑制作用密切相关，尤其是与它们明显增加蛋白酶体靶蛋白IκBα的积累量密切相关。总的来说,这些结果表明TNF-α可以增强乳腺癌细胞对WA或Celastrol敏感性在某种程度上来说是通过抑制NF-κB信号的激活从而导致了XIAP的抑制最终上调了caspase-3和9的活性。因此,TNF-α的抗癌活性在与天然的蛋白酶体抑制剂WA或Celastrol结合时增强。方法一.无菌培养乳腺癌MDA-MB-231细胞，将不同浓度的WA或celastrol分别与固定浓度的TNF-α联用或不联用并设立空白对照组，各组进行MTT细胞增殖与毒性检测实验、克隆形成实验、划痕实验检测肿瘤细胞的活性、增殖、迁移；二.无菌培养乳腺癌MDA-MB-231细胞，将不同浓度的WA或celastrol分别与固定浓度的TNF-α联用或不联用并设立空白对照组，采用流式细胞技术检测肿瘤细胞的凋亡；三.无菌培养乳腺癌MDA-MB-231细胞，将不同浓度的WA或celastrol分别与固定浓度的TNF-α联用或不联用并设立空白对照组， Western blot检测PARP、caspase-9、caspase-3、泛素化蛋白的表达情况；四.无菌培养乳腺癌MDA-MB-231细胞，将不同浓度的WA或celastrol分别与固定浓度的TNF-α联用或不联用并设立空白对照组，逆转录和荧光定量PCR技术检测XIAP及相关基因表达量；五.无菌培养乳腺癌MDA-MB-231细胞，将不同浓度的WA或celastrol分别与固定浓度的TNF-α联用并设立空白对照组，利用细胞免疫荧光技术和Western bloting检测核转录因子NFKBP65的转位情况；六.无菌培养乳腺癌MDA-MB-231细胞，将不同浓度的WA或celastrol分别与固定浓度的TNF-α联用或不联用并设立空白对照组，Western bloting检测XIAP、cIAP1/2、IKB及相关蛋白的表达情况。结果一． TNF-α增强乳腺癌细胞MDA-MB-231对WA/celastrol的敏感性，抑制了乳腺癌癌细胞的增殖和迁移；二． TNF-α增强乳腺癌细胞MDA-MB-231对WA/celastrol的敏感性，促进了乳腺癌细胞的凋亡；三．联合的TNF-α与WA/celastrol通过影响凋亡蛋白caspase-3的活性和表达水平促进了乳腺癌细胞的凋亡；四．联合的TNF-α与WA/celastrol对蛋白酶体的活性具有一定的抑制作用；五． TNF-α联合WA/Celastrol在较久的时间点影响XIAP蛋白的表达六．联合的TNF-α与WA/Celastrol对基因XIAP的表达具有一定的抑制作用七．联合的TNF-α与WA/celastrol抑制了核转录因子NFKBP65的核转位；八． WA/Celastrol抑制了TNF-α诱导的NF-κB通路的活化。结论我们的研究证实了天然蛋白酶体抑制剂WA/Celastrol可以使乳腺癌细胞MDA-MB-231对TNF-α的抗肿瘤作用变得敏感，从而促进其凋亡。WA/Celastrol主要通过对蛋白酶体的抑制作用从而抑制了IκBα的磷酸化使其不能降解，由于IκBα是NF-κB的抑制物之一，IκBα的积累则可以阻断NF-κB通路的活化从而使NF-κB下游的基因的表达也受到一定的抑制，尤其是对XIAP、cIAP1/2基因表达的间接抑制。之前已有报道指出XIAP可与凋亡启动因子caspase-9和效应因子caspase3、caspases-7直接结合导致凋亡蛋白活性被抑制，最终拮抗药物的促凋亡作用[25-28]。我们的课题验证了WA/Celastrol对XIAP的间接抑制作用在WA/Celastrol的致敏过程中起到至关重要的作用。