苯并[a]芘活化小胶质细胞致小鼠神经毒性的作用研究

来源 :山西医科大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:xtyygydskf
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目的:从体内动物实验、体外细胞培养两方面探究活化小胶质细胞引起中枢神经炎症反应在B[a]P致小鼠神经毒性中的作用,为B[a]P神经毒性机制的研究提供科学依据。方法:体内实验:将成年雄性SPF级ICR小鼠按体重随机分为4组,分别设为溶剂(花生油)对照组,0.5 mg/kg、2.0 mg/kg和10.0 mg/kg B[a]P染毒组,每组10只,腹腔注射染毒,隔天染毒1次,共染毒30次。染毒结束后,用Morris水迷宫、旷场试验、悬尾实验检测小鼠的神经行为功能和自发活动能力,用HE染色法观察小鼠皮质神经细胞的形态学变化,并用免疫荧光技术和实时荧光定量PCR(RT QPCR)检测皮质小胶质细胞的活化(特异性蛋白Iba-1的表达)。为了阐明小胶质细胞活化与神经细胞损伤之间的先后关系,又以同样剂量组的B[a]P对小鼠分别染毒20次和10次,观察小胶质细胞活化以及神经细胞的损伤,并用ELISA试剂盒检测中枢神经促炎症细胞因子IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-6和IL-12的含量随B[a]P染毒剂量和时间的变化。体外实验:以体外培养的小鼠N9小胶质细胞株和小鼠海马神经元细胞株HT22为细胞模型,研究B[a]P活化小胶质细胞在神经细胞损伤中的作用。首先,以0.2μM B[a]P、2.0μM B[a]P和20μM B[a]P作用于HT22细胞,以DMSO溶剂处理作为对照组,观察B[a]P的直接毒性效应。再将N9细胞株随机分为6组,分别是空白对照组、DMSO(溶剂)对照组,脂多糖(LPS)阳性对照组,0.2μM B[a]P、2.0μM B[a]P和20μM B[a]P染毒组,染毒6h、12h、24h和48h后,观察小胶质细胞的形态学改变,用免疫荧光技术检测小胶质细胞活化的特异性标志物(Iba-1)的表达情况,用QPCR检测Iba-1基因表达的改变。用活化N9细胞的上清液给HT22细胞全量换液12h、24h和48h后,观察HT22细胞的形态学改变,CCK8法检测细胞活力的改变。并用米诺环素抑制N9细胞的活化后,用上述方法,观察B[a]P对HT22细胞的毒性作用。综合以上研究结果,分析活化小胶质细胞在B[a]P致神经细胞损伤中的可能作用。结果:(1)体内实验结果显示,B[a]P染毒30次后,随着染毒剂量的增加,小鼠的空间学习记忆能力和自发行为活动逐渐降低,抑郁样行为逐渐增多,显著高于溶剂对照组(P<0.05)。HE染色结果显示,与溶剂对照组相比,低剂量组神经细胞出现中度肿胀,有神经纤维脱髓鞘现象,中、高剂量组神经细胞出现了变性、坏死,可见卫星现象和噬神经现象,亦有散在的细胞出现肿胀。免疫荧光和Iba-1基因表达量检测结果显示,随着染毒剂量的增加,小胶质细胞活化程度升高,Iba-1基因表达量逐渐增高(P<0.05)。同样剂量组的B[a]P对小鼠染毒20次后,HE染色结果显示,与溶剂对照组相比,低剂量组神经细胞出现轻度肿胀,中剂量组神经细胞肿胀明显,且有神经纤维的溶解,高剂量组有神经细胞的变性、坏死,可见噬神经现象,而反映小胶质细胞活化的标志物Iba-1在基因和蛋白表达水平均随着染毒剂量的增加逐渐增多;染毒10次后,HE染色结果显示,与溶剂对照组相比,低剂量组神经细胞排列均匀、整齐,形态未见明显异常,中剂量组神经细胞出现轻度肿胀,高剂量组神经细胞出现重度肿胀,中、高剂量组均未出现神经细胞的变性、坏死。对中枢神经促炎症细胞因子的检测结果显示,染毒10次后,各染毒组IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-6和IL-12的含量呈剂量依赖性的升高,均显著高于溶剂对照组(P<0.05);这些促炎症因子的含量在染毒20次、30次后,仍然维持在较高的水平,均显著高于溶剂对照组(P<0.05)。而且,随着染毒次数的增加,各染毒组IL-1β的含量持续升高,与染毒10次相比,各染毒剂量组染毒20次和30次时的IL-1β的含量均显著升高(P<0.05);TNF-α的含量在中、高剂量组染毒10次时已分别达到溶剂对照组的1.5倍和2倍,且随着染毒次数的增加,其含量仍保持在较高的水平;各组MCP-1和IL-6的含量在染毒20次时达到最高水平,染毒30次后有所下降,但仍高于染毒10次时的含量;而IL-12随着染毒次数的增加,在各染毒组的含量变化不明显(P>0.05)。(2)体外实验结果显示,经不同剂量的B[a]P染毒的HT22神经细胞,其形态学以及细胞活力均没有明显的变化,提示B[a]P对神经元几乎不具有直接的毒效应。0.2μM B[a]P、2.0μM B[a]P和20μM B[a]P作用于N9小胶质细胞6h、12h、24h和48h后,小胶质细胞明显活化,呈阿米巴样形态,其活化的特异性标志蛋白Iba-1的表达随染毒剂量和染毒时间均显著地增加。Image J软件分析结果显示,染毒24h为小胶质细胞活化最明显的时间点。用B[a]P作用N9小胶质细胞24h的上清液染毒HT22神经细胞,随染毒剂量的增加和染毒时间的延长,细胞存活率逐渐降低。米诺环素可以抑制小胶质细胞的活化,用米诺环素与20μM B[a]P共同作用于N9小胶质细胞的上清液染毒HT22细胞12h后,细胞活力检测,米诺环素与20μM B[a]P共同作用组的细胞存活率要明显高于20μM B[a]P组(P<0.05)。结论:1.B[a]P具有神经毒性,能引起小鼠空间学习记忆能力降低,自发活动能力下降和抑郁样行为增多。2.中枢神经炎症反应以及神经细胞的损伤可能是B[a]P神经毒作用的主要机制。3.活化小胶质细胞引起的神经炎症反应介导了B[a]P的神经毒性,抑制小胶质细胞活化可延缓或减轻B[a]P对神经细胞的损伤。
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