乳酸链球菌素(Nisin)是一种由特定乳酸乳球菌生产的抗菌肽,可抑制大多数革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌。Nisin早在1969年就已被联合国粮食及农业组织和世界卫生组织确认为安全无毒的天然食品防腐剂。近年来,随着细菌耐药性问题的日益严重,nisin也被认为有潜力作为抗生素替代品用于临床试验,且在皮肤软组织感染、艰难梭菌引起的腹泻及癌症治疗中展示了良好的效果。然而,nisin较低的产量和较高的生产成本限制了其更广阔的应用。因此,我们从构建nisin高产菌株、开发低成本生产体系及提高发酵产品的应用效果三个方面进行了研究,主要研究结果如下:与很多厌氧菌相似,乳酸乳球菌主要通过糖酵解途径获得能量用于生长和生产。然而丙酮酸主要转化为乳酸,随着发酵的进行,乳酸的积累及环境的酸化抑制了糖酵解途径,这是限制乳酸乳球菌菌体量和nisin产量的一个重要因素。另外,nisin发酵过程中还存在着菌株最适pH是中性而nisin在酸性条件下稳定的矛盾,这也增加了发酵过程的复杂性。本研究首次报道了通过引入碳代谢分流途径提高菌株的耐酸能力和能量供应。我们首先通过酸胁迫转录组组学分析及实验验证筛选了目标分流代谢物,之后引入了这些代谢物的合成途径。为缓解工程菌株氧化还原辅因子不平衡的问题,通过表达NADH氧化酶和增加发酵溶氧量降低了胞内NADH/NAD~+比例,为碳代谢流流向目标代谢物提供了驱动力。另外我们利用酸响应启动子实现了分流途径的分步调控,提高了nisin产量并缩短了发酵时间。经历了多年来在营养丰富环境中(牛奶,肉,水果等)的不断进化,多种代谢物合成途径的缺陷使得乳酸乳球菌对外界营养的要求非常挑剔。目前乳酸乳球菌发酵生产Nisin的工业培养基中,蔗糖和葡萄糖等精制糖被用来作为碳源,大量昂贵的高品质氮源(包括蛋白胨、玉米浆及酵母膏等)通常被混合使用以确保乳酸乳球菌的菌体生长和nisin生产。因此,采用农业废弃物作为更加廉价的工业发酵底物,是一种降低nisin生产成本的有效策略。本研究中我们利用脱脂米糠(DRB)作为碳源、脱脂豆粕(DSM)作为氮源进行nisin发酵,开发了三种nisin生产体系:1)SHRSF工艺:分别利用糖化酶和蛋白酶对热处理后DRB和DSM进行酶解,将所得DRB酶解液和DSM酶解液混合后制备nisin发酵培养基;2)CHRSF工艺:将热处理后DRB和DSM混合后利用糖化酶和蛋白酶一同酶解,所得酶解液制备nisin发酵培养基;3)SHFRS工艺:将热处理后DRB和DSM混合后制备nisin发酵培养基进行同步酶解发酵。三种工艺的nisin产量分别可达3629、3579和1870 IU/mL。并进一步通过表达NADH氧化酶和添加血红素激活乳酸乳球菌的有氧呼吸作用,使得同步酶解发酵工艺的nisin产量提高了70%。为节省nisin提取纯化成本,很多情况下,半纯化nisin或者nisin发酵液直接应用于食品保鲜,虽节省了成本,但保鲜效果也有所降低。为进一步提高nisin发酵产品的保鲜效果,我们开发了联产nisin和γ-氨基丁酸(GABA)的乳酸乳球菌发酵体系。作为一种GRAS类非蛋白氨基酸,GABA在食品保鲜中的应用近年来引起了广泛关注,它能够通过抗氧化、冻伤和抗菌等作用维持食品质量并延长储藏时间。该体系中,我们首先在F44中过表达谷氨酸脱羧酶GadB和谷氨酸/GABA转运蛋白GadC,重组菌株F44/GadB1C1摇瓶发酵24 h后GABA产量达到2.26 g/L,谷氨酸钠转化率为84.2%。且F44/GadB1C1的耐酸能力和nisin生产能力较F44都有所提高。然后通过两步pH控制发酵,F44/GadB1C1在发酵罐补料发酵中的GABA产量达到9.12 g/L,是维持pH 6的传统乳酸乳球菌发酵模式的2.2倍,谷氨酸钠转化率为74.4%。另外,该策略也降低了nisin的降解速度。F44/GadB1C1的F44/GadB1C1发酵液的冻干产物展现出了良好的抗氧化能力,其DPPH和ABTS~+自由基清除能力强于同浓度BHA。最后我们将F44/GadB1C1发酵产物用于猪肉冷藏和草莓储藏过程中,能有效缓解猪肉的脂质氧化和微生物污染,减缓草莓的腐烂和表皮颜色变化。