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背景和目的： miR-335在卵巢癌中低表达，是卵巢癌复发的独立风险因素，且参与调控癌细胞的侵袭转移能力，但其低表达的分子机制尚不清楚。转录因子Sp1在卵巢癌中高表达，促进卵巢癌的增殖和转移。且Sp1可以通过调节DNA甲基转移酶的表达进而负向调节基因表达。本课题拟阐明Sp1是否通过抑制miR-335表达,促进肿瘤增殖和迁移。 方法： 1．构建靶向沉默Sp1的短发卡RNA（shRNA）质粒shSp1，转染A2780、SKOV3细胞构建低表达Sp1的卵巢癌细胞株，转染shNC的细胞为阴性对照。同时利用Sp1抑制剂光神霉素（Mithramycin A）处理A2780、SKOV3细胞抑制Sp1表达。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹(WB)检测两种方法下调Sp1的效率。 2．qRT-PCR检测下调Sp1后miR-335表达变化。 3．miR-335拮抗剂（miR-335 inhibitor）转染用于下调miR-335的表达。 4．细胞分四组：：shNC组、shSp1组、shSp1/inhibitor阴性对照组（shSp1+miR-335 inhibitor NC）和共转染组（shSp1+miR-335 inhibitor）。划痕实验和Transwell小室迁移实验检测细胞的迁移能力，EdU增殖实验检测细胞的增殖能力。 5．构建含miR-335-启动子的双荧光素酶报告基因转染细胞，验证Sp1对miR-335转录活性的调控。 6． A2780和SKOV3细胞系下调Sp1后，利用qRT-PCR实验检测三种甲基化转移酶（DNMT1、DNMT3a和DNMT3b）的表达变化。 结果： 1.与shNC细胞相比，转染shSp1的A2780、SKOV3细胞中Sp1的mRNA表达水平分别下降49%（PA2780=0.011）和47%（PSKOV3=0.007）；光神霉素处理后A2780和SKOV3细胞中Sp1 mRNA的表达下调均大于80%（PA2780<0.001， PSKOV3=0.006）。蛋白免疫印迹检测Sp1蛋白水平变化与PCR结果一致。 2.与shNC细胞相比，转染shSp1的A2780、SKOV3细胞中miR-335表达水平分别上调了1.8倍（PA2780=0.042）和1.7倍（PSKOV3=0.021）；利用光神霉素下调Sp1后A2780和SKOV3细胞中miR-335的表达分别上调3.3倍（PA2780=0.027）和1.3倍（PSKOV3=0.045）。 3.与inhibitor NC组相比，miR-335 inhibitor转染shSp1-A2780和shSp1-SKOV3细胞后，qRT-PCR提示 miR-335的敲除效率均达80%以上（P<0.001）。 4.与shNC细胞相比，划痕实验显示shSp1转染的A2780和SKOV3细胞迁移能力分别下降了51.8%（PA2780<0.001）和65%(PSKOV3<0.001)；Transwell迁移细胞数分别降低了66.2%(PA2780=0.035）和65.3%(PSKOV3=0.03）,而shSp1+miR-335 inhibitor细胞与shSp1+miR-335 inhibitor NC细胞相比迁移距离百分比分别提高了1.4倍（PA2780=0.005）和2.4倍（PSKOV3<0.001），迁移细胞数量分别提高了5.1倍（PA2780=0.002）和4.6倍（PSKOV3<0.02）。提示下调miR-335可以逆转下调Sp1所致的肿瘤细胞迁移抑制。 5.在A2780和SKOV3组细胞中，shSp1细胞与shNC细胞相比增殖能力分别降低了51%（PA2780=0.001）和28%(PSKOV3=0.03)；而shSp1+miR-335 inhibitor细胞和shSp1+miR-335 inhibitor NC细胞相比增殖能力无明显变化。 6.荧光素酶报告实验显示，与溶剂对照组相比，光神霉素处理可以显著增强miR-335启动子的转录活性。 7.光神霉素可以下调三种甲基化转移酶（DNMT1、DNMT3a和 DNMT3b）的mRNA的表达。 结论： 转录因子 Sp1能够通过抑制 miR-335的转录促进上皮性卵巢癌的迁移，而Sp1对miR-335的调控是否由启动子甲基化介导还有待进一步研究。