论文部分内容阅读
奶牛乳腺炎一直是奶牛养殖业和奶制品行业最大的挑战之一,制约着奶业的健康发展。有效进行奶牛乳腺炎的防治,可以为奶牛的健康、生产优质乳制品提供良好保障。随着耐药性问题日益突出,如何有效的防治奶牛乳腺炎,寻找新的抗生素替代物质,成为当前的研究热点之一。茶树油因其抗菌谱广、抗菌活性强,可有效治疗由真菌、细菌或病毒引起的相关疾病,逐渐进入研究者的视野,有望在进一步研究开发后成为新一代有效抗菌物质。本研究以此为切入点,探究了茶树油的抑菌效果及其在牛乳腺上皮细胞(Mac-T)中对LPS的拮抗作用。本研究首先对茶树油体外抑菌效果进行了试验,以此来确定茶树油对常见的奶牛乳腺炎致病菌是否具有一定的抑菌效果。此后,为良好的模拟大部分革兰氏阴性菌侵染奶牛乳腺组织所诱发的奶牛乳腺炎,本研究构建了 LPS诱导的奶牛乳腺炎细胞模型。最后,通过在构建的奶牛乳腺炎细胞模型中添加不同浓度的茶树油,探究茶树油对于LPS的拮抗作用,并确定茶树油的适宜添加浓度。以上试验探究了茶树油治疗奶牛乳腺炎的可行性,为茶树油开发成为奶牛乳腺炎有效抗菌物质提供了参考。本次研究结果如下:1、茶树油对奶牛乳腺炎常见致病菌的抑菌效果:选取本地牧场分离的奶牛乳腺炎5种常见致病菌:金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、弗格森埃希氏菌、蜡样芽胞杆菌,对这些菌株进行复苏、传代及冻存。选取状态良好的菌株,在这些菌株上进行茶树油的药敏试验,结果显示:5种菌对于20%浓度的茶树油均为中敏,对10%浓度的茶树油敏感度介于中敏和低敏之间,而对于5%浓度的茶树油只为低敏。进一步对茶树油进行MIC试验,选用菌株仍为这5种菌株,结果显示:茶树油对于金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、弗格森埃希氏菌和蜡样芽胞杆菌的MIC浓度为1.6%,对于绿脓杆菌的MIC浓度为1.8%。以上结果表明:茶树油对于金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、弗格森埃希氏菌、蜡样芽胞杆菌这五种常见奶牛乳腺炎致病菌具有一定的抑菌效果。2、LPS诱导的奶牛乳腺炎细胞模型的构建:将牛乳腺上皮细胞(Mac-T)进行复苏、传代及冻存。选取状态良好的细胞,在这些细胞的培养中分别添加50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的LPS进行相关指标的检测。首先使用CCK-8法检测细胞增殖活性,结果显示100μg/mL的LPS诱导12h条件下,细胞已开始出现活性下降情况。进一步使用流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果显示100μg/mL的LPS诱导12h条件下并未出现大量的细胞凋亡,而200μg/mL的LPS诱导12h后约有46%左右的细胞出现了早期凋亡和晚期凋亡。选用200μg/mL LPS诱导12h作为后续实验模型,并利用qPCR试验检测炎症因子与凋亡因子的表达量,结果显示TNF-α表达量约是空白对照组的16倍,IL-6表达量约是空白对照组的18倍(P<0.01),与凋亡反应相关的STAT1因子表达量约是空白对照组的6倍(P<0.01)。进一步使用ELISA法检测炎症蛋白和凋亡蛋白表达量,结果显示炎症蛋白NF-κB的表达量约是空白对照组的2.1倍(P<0.01),MAPK的表达量约是空白对照组的4.4倍(P<0.01),凋亡蛋白Caspase-3的表达量约是空白对照组的7.7倍(P<0.01)。以上结果表明:本次试验中,200μg/mL LPS诱导12h可作为奶牛乳腺炎细胞模型的构建条件。3、奶牛乳腺炎细胞模型中茶树油对LPS的拮抗作用:在200μg/mL LPS诱导12h的奶牛乳腺炎细胞模型中分别添加0.0002%、0.0004%、0.0006%、0.0008%、0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.01%的茶树油进行相关指标的检测。首先使用流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果显示添加茶树油浓度为0.0004%、0.0006%、0.0008%时细胞的凋亡比例会有所下降,其中添加茶树油浓度为0.0006%的这一组保护效果最为明显,其活细胞比例71.95%,早期凋亡细胞比例22.15%,晚期凋亡细胞比例5.11%,与未添加茶树油的乳腺炎模型组相比活细胞相比提高了约22%。之后对有保护效果的三组进行qPCR检测细胞因子与凋亡因子表达量,结果显示随着加入茶树油的浓度上升,TNF-α表达量下调的较多,IL-6的表达量下调的较少(P<0.01),STAT1的表达量在加入0.0004%浓度茶树油时有轻微的上调,在0.0006%和0.0008%浓度时表达量略微下调,其中添加0.0006%浓度茶树油表达量最低(P<0.05)。进一步使用ELISA法检测炎症蛋白和凋亡蛋白表达量,结果显示添加三组不同浓度的茶树油均极显著降低了NF-κB、MAPK和Caspase-3的表达量,其中,0.0006%浓度茶树油组较其余浓度组的炎症反应蛋白的表达量最低,约为空白对照组的50%(P<0.05),而这三组的凋亡反应相关蛋白表达量则几乎持平,约为空白对照组的55%(P<0.05)。以上结果表明:在Mac-T中0.0004%-0.0008%浓度的茶树油对于LPS具有拮抗,其中0.0006%浓度茶树油对于LPS拮抗作用最为明显。综上所述,茶树油对于奶牛乳腺炎几种常见致病菌具有一定的抑菌作用,并在适宜浓度范围内对LPS有一定的拮抗作用,可以降低细胞凋亡比例,提高正常细胞的存活比例,下调细胞因子和通路蛋白的表达量。