糖尿病（Diabetes mellitus,DM）是世界上最大的健康问题之一,已成为一个主要的公共健康关注问题。糖尿病患者患心脏病的几率较非糖尿病患者明显增加。而糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy,DCM）成为全球糖尿病患者发病和死亡的主要原因。DCM是一种常见的特异性心肌病,是不能用高血压病、冠状动脉疾病、瓣膜病及其他心血管疾病来解释的心肌损伤。DCM的病理学改变为心肌细胞肥大、凋亡、坏死及心肌间质纤维化。DCM患者早期不易被发现,可进一步进展为心力衰竭。因此,研究其发病机制,并做好预防和延缓疾病的进程具有重要的意义。DCM的病理进展是复杂的,多种因素与DCM的发病有关,包括了糖代谢异常和胰岛素抵抗、细胞外基质（ECM）重塑、钙离子调节失衡、氧化应激的增加、炎症反应、代谢谱的改变、内皮功能障碍等。一些信号通路和蛋白例如:蛋白激酶C（PKC）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、核因子-κB（NFκB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）也被发现参与了DCM的发生。除此之外,葡萄糖水平的升高会导致线粒体活性氧（ROS）的产生,可诱导心肌细胞凋亡和线粒体功能障碍,从而导致DCM的发生。心肌细胞凋亡对心脏结构和功能的损伤是DCM发展的重要环节。DCM早期即可出现心肌细胞的异常凋亡,在高糖水平下,这很可能与基因异常的表达相关,最终激活细胞的程序性死亡。心肌细胞凋亡通路主要包括线粒体凋亡通路、内质网应激凋亡通路和死亡受体凋亡通路。其中线粒体凋亡通路是由线粒体所介导,通过将细胞色素C转移至胞浆,最终导致细胞的凋亡。目前在细胞凋亡调控基因中,经典的参与线粒体凋亡通路的B细胞白血病/淋巴瘤-2（Bcl-2）基因家族和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族最受关注。Bcl-2家族包括抗凋亡成员如Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、髓系细胞白血病-1（Mcl-1）等,及促凋亡成员如Bcl-2相关X蛋白质（Bax）、Bim、Bak1等,它们都在抑制或促进促凋亡蛋白的作用中发挥重要作用。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）是caspase家族重要的成员,为内源性和外源性两种凋亡途径的共同下游作用分子;抗凋亡Bcl-2因子的主要功能是抑制Bax和Bak1的活化;Bak1为促凋亡蛋白,与Bax通过在线粒体外膜上形成一个孔,在介导细胞色素释放,诱导细胞凋亡中起到重要作用。既往关于Bak1在植物中的研究较多,在动物体内参与细胞凋亡的研究较少,因此我们关注了Bak1,并将其作为本研究的主要内容之一。微小RNAs（mi RNAs）是长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA,通过抑制翻译或裂解信使RNA（m RNA）以调节转录后的基因表达。研究表明,mi RNAs参与多种生物过程,包括细胞增殖、分化、转移、凋亡、葡萄糖代谢、脂肪代谢等。即便是微量的mi RNAs水平变化也可导致生物化学和生理通路的中断,从而导致各种疾病的发生。mi RNAs在DCM心脏组织中表达水平异常,被认为是导致DCM心脏肥厚、重构和心力衰竭进展的重要机制。在高糖条件下,mi RNA介导的信号可以转移到其他细胞或组织,而在糖尿病性心肌病的不同阶段,血液中出现的循环mi RNAs的稳定水平也会发生改变。因此,mi RNAs可能在诊断、预防和治疗糖尿病心肌病中发挥潜在的作用。mi R-29家族主要由mi R-29a、mi R-29b-1、mi R-29b-2和mi R-29c组成,其中mi R-29b-1和mi R-29b-2统称为mi R-29b。mi R-29家族靶基因主要存在于细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、迁移等生物相关过程中,因此在生物的进程和发展过程中发挥着重要的调节作用。既往mi R-29家族多研究于肝纤维化、肿瘤等相关疾病。近年来越来越多关于mi R-29参与心血管疾病发生发展机制的研究表明,mi R-29家族在心血管组织和血管内皮细胞、主动脉组织、心肌组织和心肌细胞、心脏代谢等多个部位均具有调节活性。而mi R-29家族与糖尿病心肌病关系的研究主要集中在糖尿病心肌病血管生成、糖尿病胰岛素抵抗、全身炎症反应及其所引发靶器官和组织的糖代谢、脂代谢异常等方面。近期有研究,mi R-29b通过直接靶向Bax抑制线粒体依赖通路,防止阿霉素诱导的心肌细胞凋亡。mi R-29a是否通过细胞凋亡途径参与调控DCM的发病机制的研究尚未见报道,这成为我们研究的一个切入点。综上所述,我们推测mi R-29a在糖尿病心肌病的心脏组织及外周血液中均发生变化。本研究选择糖尿病心肌病患者,检测其外周血mi R-29a、N末端脑钠肽（NT-pro BNP）水平的变化,行心脏彩超检测其心脏功能相关指标,明确外周血中mi R-29a水平与糖尿病心肌病心脏功能的关系。为进一步探讨mi R-29a参与DCM的机制,我们采用链脲佐菌素（STZ）建立DCM大鼠模型,定量实时聚合酶链式反应（q RT-PCR）检测心肌组织中mi R-29a的表达;利用体外培养H9c2细胞进行实验,采用流式细胞术检测细胞凋亡水平,q RT-PCR和蛋白印迹（WB）分析mi R-29a和凋亡相关基因和蛋白的表达水平。预测靶基因,利用双荧光素酶报告基因技术验证mi R-29a和靶基因关系。最后将DCM大鼠心肌注射携带阴性对照mimics或mi R-29a-3p mimics慢病毒,在体内进行验证和研究,从而探讨mi R-29a参与糖尿病心肌病的可能发病机制。本研究主要包括以下五部分:第一部分mi R-29a在糖尿病心肌病患者外周血中的表达及其价值目的:1.观察糖尿病心肌病患者外周血中mi R-29a水平的变化。2.探讨外周血中mi R-29a水平与糖尿病心肌病患者心脏功能指标的关系。方法:1.收集糖尿病心肌病患者（DCM）6例和健康对照者（NC）10例,并采集入选者一般临床资料。2.对两组入选者采集肘静脉血,检测生化系列、NT-pro BNP水平。3.应用TRIzol LS regent对静脉血进行总RNAs的提取,再进行逆转录和荧光定量PCR检测,得到两组入选者外周血中mi R-29a的相对表达量。4.对两组入选者行心脏超声心动图检查,检测左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩窄率（LVFS）、舒张期末室间隔厚度（IVST）、左室后壁厚度（LVPWT）、左室收缩末内径（LVIDS）、左室舒张末内径（LVIDD）等心功能指标。结果:1.一般临床资料比较:两组研究对象在年龄、收缩压、舒张压、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。与健康对照组比较,DCM组患者的体重指数、尿素氮、肌酐、尿酸、空腹血糖、NT-pro BNP水平均升高,而高密度脂蛋白胆固醇水平低于健康对照组,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。2.外周血mi R-29a水平测定:DCM组的mi R-29a表达水平明显高于健康对照组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。3.超声心动图比较:与健康对照组相比,DCM组患者的左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩窄率（LVFS）明显降低,左室后壁厚度（LVPWT）、左室收缩末内径（LVIDS）和左室舒张末内径（LVIDD）值明显升高,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。4.mi R-29a的水平与不同指标的相关性分析:mi R-29a的水平与LVEF和LVFS呈明显的负相关关系（P＜0.0001）;mi R-29a的水平与LVPWT,LVIDS,LVIDD和NT-pro BNP水平,呈明显的正相关关系（P＜0.05）。小结:1.mi R-29a在DCM患者的外周血中表达水平明显升高。2.外周血中mi R-29a的水平与DCM患者心功能呈负相关性。第二部分糖尿病心肌病大鼠模型的建立及mi R-29a在大鼠心肌组织中的表达目的:1.观察糖尿病心肌病大鼠模型心功能情况及心肌组织形态变化。2.观察糖尿病心肌病大鼠心肌组织中mi R-29a水平的变化。方法:1.将成年雄性SD大鼠分为糖尿病心肌病组（DCM）、正常对照组（NC）,DCM组大鼠给予高脂高糖喂养,于第4、5周末分别腹腔注射链脲佐菌素（STZ,30mg/kg）,NC组给予普通饲料喂养,在相同时间分别腹腔注射柠檬酸钠缓冲液（30mg/kg）,均喂养至满14周。以血糖指标确定2型糖尿病建模成功,以M型超声心动图检测大鼠的心功能改变,以苏木精-伊红（HE）染色法观察心肌病理组织形态变化,以确定DCM建模成功。2.采用q RT-PCR技术检测mi R-29a在DCM组和正常组大鼠心肌组织中的表达水平。结果:1.DCM大鼠模型的建立1)动物模型基本情况:DCM组大鼠成模7只,正常组大鼠10只均存活。与NC组大鼠相比,DCM大鼠血糖水平明显升高（P＜0.05）,而成模时体重反而下降（P＜0.05）。2)M型超声心动图检测:DCM大鼠左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩窄率（LVFS）、舒张早期心室充盈最大速度（E）、舒张早期心室充盈最大速度/舒张晚期心室充盈最大速度（E/A比值）明显降低（P＜0.05）,而舒张晚期心室充盈最大速度（A）、左室收缩末内径（LVIDS）、左室舒张末内径（LVIDD）明显升高（P＜0.05）。3)心肌组织形态学变化:心肌细胞HE染色结果显示,DCM大鼠与NC组相比心肌细胞大小不等,细胞排列混乱,细胞核稀疏,细胞间质结构发生变性、坏死等改变。2.mi R-29a在两组大鼠心肌细胞中的表达mi R-29a在DCM大鼠心肌组织中的表达与NC组大鼠相比明显下调（P＜0.05）。小结:mi R-29a在DCM大鼠心肌组织中表达明显下调,提示其可能参与了DCM的发病机制。第三部分高糖诱导的心肌细胞中mi R-29a的变化及其对心肌细胞凋亡的影响目的:1.观察高糖条件对大鼠心肌细胞凋亡的影响。2.观察高糖条件下心肌细胞中mi R-29a表达水平的变化。3.过表达mi R-29a对高糖诱导的心肌细胞凋亡的作用。方法:1.将实验大鼠心肌细胞细胞系（H9c2）通过培养,并使用Lipofectamine 2000转染试剂盒转染mi R-29a模拟剂和阴性对照序列,分为正常葡萄糖组（Normal Glucose,NG;5.5m M）、高糖组（High Glucose,HG;33m M）、高糖+mi R-29a模拟剂组（High glucose+mi R-29a mimics,HG+mi R-29a mimics）、高糖+模拟剂阴性对照组（High glucose+negative control mimics,HG+NC mimics）。采用流式细胞术检测HG组在0h、12h、24h、36h时间节点的凋亡率,并检测四组心肌细胞在高糖诱导24小时的凋亡情况,并进行比较。2.采用蛋白印迹法测定各组心肌细胞中凋亡相关因子Bcl-2、Mcl-1、Bax、Caspase-3、Bak1的蛋白表达情况。3.采用q RT-PCR检测技术测定四组心肌细胞H9c2中mi R-29a的表达水平。结果:1.高糖诱导可增加大鼠心肌细胞凋亡率,过表达mi R-29a能降低高糖诱导的心肌细胞细胞凋亡率:在高糖诱导下,随着培养时间的延长,大鼠心肌细胞凋亡率逐渐升高。转染mi R-29a mimics和NC mimics后,与NG组相比,HG组心肌细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）,与HG组、HG+NC mimics组分别相比,HG+mi R-29a mimics组心肌细胞凋亡水平明显降低（P＜0.05）。2.高糖对大鼠心肌细胞中细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响及过表达mi R-29a对高糖诱导的心肌细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响:与NG组相比,HG组心肌细胞中凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Bak1的表达增加（P＜0.05）,其中Caspase-3、Bak1表达显著增加（P＜0.001）,抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表达显著降低（P＜0.05）,与HG组、HG+NC mimics组分别相比,转染mi R-29a mimics后的心肌细胞凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Bak1的表达显著降低（P＜0.05）,而抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表达明显增加（P＜0.05）。3.高糖可使心肌细胞中mi R-29a的表达下调,转染mi R-29a mimics后心肌细胞中mi R-29a表达水平上调:与NG组相比,HG组心肌细胞中的mi R-29a的表达显著降低（P＜0.05）,与HG组、HG+NC mimics组分别相比,转染mi R-29a mimics后的心肌细胞中mi R-29a的表达水平显著升高（P＜0.05）。小结:1.高糖培养下,心肌细胞凋亡水平增加,心肌细胞中mi R-29a的表达水平降低。2.高糖能通过升高细胞凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Bak1的表达和降低抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表达来促进心肌细胞凋亡。3.mi R-29a可以通过调控细胞凋亡相关因子的表达降低高糖诱导的心肌细胞凋亡。第四部分mi R-29a通过靶向Bak1抑制线粒体依赖通路参与调控高糖诱导的心肌细胞凋亡目的:探讨mi R-29a通过靶基因Bak1调控高糖诱导的心肌细胞凋亡的机制。方法:1.利用micro RNA靶基因预测Target Scan数据库、mi Randa数据库及Pic Tar数据库,对mi R-29a的潜在靶基因的3’非翻译区（3’untranslated region,3’UTR）序列进行分析,预测mi R-29a-3p与Bak1的结合基因。2.双荧光素酶报告基因技术验证mi R-29a和靶基因Bak1之间的关系。3.采用蛋白印迹法测定转染mi R-29a mimics对靶基因Bak1蛋白表达水平的影响。结果:1.mi R-29a靶基因的生物信息学预测:Target scan7.2生物信息学软件（http://www.targetscan.org/）预测了mi R-29a-3p与Bak1的基因结合位点。2.Bak1是mi R-29a的直接调控靶点的验证:采用双荧光素酶报告基因技术,分别将mi R-29a-3p mimics或NC mimics与Bak1-3’UTR野生结构（Bak1-Wt）或Bak1-3’UTR突变结构（Bak1-Mut）共转染心肌细胞后,结果显示,mi R-29a可以通过与Bak1-3’UTR序列结合,抑制荧光素酶相对活性,而突变靶点的荧光素酶活性不受影响。3.mi R-29a过表达对心肌细胞中预测靶基因Bak1表达的影响:H9c2细胞中过表达mi R-29a能降低Bak1在蛋白水平的表达。小结:Bak1为mi R-29a的直接靶基因,mi R-29a可以通过靶向Bak1参与高糖诱导的心肌细胞凋亡。第五部分mi R-29a在糖尿病心肌病发生发展中的作用目的:1.观察过表达mi R-29a的DCM大鼠心功能及心肌组织形态变化。2.观察过表达mi R-29a对DCM大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法:1.将成年雄性SD大鼠分为对照组（n=3）,DCM组（n=9）,DCM组大鼠均按照本实验第二部分方法成功造模。将DCM大鼠随机分为:DCM组（n=3）,DCM+NC mimics组（n=3）,DCM+mi R-29a mimics组（n=3）。再给予相应组大鼠心肌注射携带NC mimics或mi R-29a-3p mimics慢病毒,以M型超声心动图检测各组大鼠的心功能情况;取心肌组织,采用苏木精-伊红（HE）和马森氏三色（Masson’s trichrome staining）染色法,分别检测心肌细胞肥大及纤维化情况。2.采用流式细胞术检测四组大鼠心肌细胞的凋亡情况。3.采用蛋白印迹法测定各组心肌细胞中凋亡相关因子Bcl-2、Mcl-1、Bax、Caspase-3、Bak1的蛋白表达情况。结果:1.mi R-29a对DCM大鼠心脏功能的影响:与对照组大鼠相比,DCM大鼠LVEF、LVFS、E值、E/A比值明显降低（P＜0.05）,A值、LVIDS、LVIDD明显升高（P＜0.05）;DCM大鼠心肌注射mi R-29a mimics后,LVEF、LVFS得到了明显提高（P＜0.01）,而A值、LVIDS、LVIDD明显降低（分别为P＜0.05,P＜0.0001和P＜0.0001）;注射NC mimics的DCM大鼠并没有这种改变。2.mi R-29a对DCM大鼠心肌组织形态学的影响:心肌细胞HE染色结果显示,DCM组、DCM+NC mimics组大鼠与对照组相比心肌细胞出现肥大,细胞排列混乱,细胞核稀疏,细胞间质结构发生变性等改变。注射mi R-29a mimics的DCM大鼠心肌细胞的这种病理改变较轻,细胞肥大情况也减轻（P＜0.01）;Masson染色显示,对照组心肌纤维无明显变化,排列均匀,无胶原沉积,DCM组、DCM+NC mimics组心肌纤维明显增加,而注射mi R-29a mimics的DCM大鼠心肌纤维化明显减轻（P＜0.01）。3.mi R-29a对DCM大鼠心肌细胞凋亡的影响:与对照组相比,DCM组、DCM+NC mimics组大鼠心肌细胞凋亡率均明显增加（P＜0.001）。而心肌注射mi R-29a mimics后,细胞凋亡率降低（P＜0.05）。4.mi R-29a对DCM大鼠心肌细胞凋亡蛋白表达的影响:与对照组相比,DCM组、DCM+NC mimics组大鼠心肌细胞中凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Bak1的表达增加（P＜0.05）,抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表达降低（P＜0.0001）。mi R-29a的上调抑制了Bax、cleaved-caspase-3和Bak1的水平（分别为P＜0.001,P＜0.01和P＜0.05）,并提高了DCM大鼠心肌细胞中Bcl-2和Mcl-1的水平（均P＜0.001）。小结:mi R-29a通过调节细胞凋亡途径参与了DCM的发病机制。结论:mi R-29a通过靶向Bak1参与糖尿病心肌病的发病机制。