鲜艳乳菇(Lactarius vividus)多糖的制备及其结构与生物活性分析

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鲜艳乳菇(Lactarius vividus)为担子菌门(Basidiomycota)红菇科(Russulaceae)乳菇属(Lactarius)真菌,在我国中部及南部地区广泛分布,为我国重要的野生食用菌资源。由于形态特征与属内部分物种差异较小,在以往的研究中,鲜艳乳菇被认为是松乳菇、橙黄乳菇或红汁乳菇等。直至2015年,才有研究学者通过采用ITS序列分析并结合形态学特性确立鲜艳乳菇为一个存在历史悠久的独立物种。到目前为止,有关鲜艳乳菇的营养价值、化学成分及生物活性等方面的研究尚未展开。因此,本研究以鲜艳乳菇子实体为试验材料,对其化学成分进行初步探索;同时对其多糖的制备、结构及生物活性进行系统研究。旨在为鲜艳乳菇的开发利用提供科学的理论依据和技术支持。主要研究结果如下:(1)鲜艳乳菇干燥子实体碳水化合物、脂肪、蛋白质和灰分含量分别为66.61、4.82、17.19和8.62%;脂肪中油酸与亚油酸两种不饱和脂肪酸占比较高,分别为48.37和29.49%;镁、钙、铁、锌和锰五种矿质元素含量较高,分别为1244.29、247.07、197.01、52.34和23.12 mg/kg;游离氨基酸、呈味5′-核苷酸、游离糖和有机酸等非挥发性呈味物质含量丰富,分别为33.89、13.01、128.15和12.67 mg/kg;挥发性物质中脂肪酸占比为84.23%,醛类物质占比为14.77%;鲜艳乳菇子实体乙醇提取物和水提取物均具有良好的自由基清除活性,且水提取物较乙醇提取物活性更强。(2)超声波辅助、微波辅助、酶辅助及热水浸提四种提取方法制备鲜艳乳菇多糖得率分别为3.74、3.09、3.33和3.63%;化学成分分析及FT-IR扫描结果显示四种多糖均为含有蛋白质的杂多糖,其单糖组成主要为半乳糖、葡萄糖、岩藻糖和甘露糖;自由基清除试验和金属离子螯合试验表明鲜艳乳菇多糖具有良好的体外抗氧化能力,且不同提取方法所得的多糖间抗氧化活性有一定差异。(3)在单因素试验结果基础上,采用响应面优化法得到热水浸提鲜艳乳菇多糖的最佳提取工艺为:提取温度100°C、提取时间3.5 h、提取次数4次和液料比40 m L/g,在此条件下,多糖得率为6.09%;以蛋白质去除率和多糖回收率为共同评价指标优化得到Sevag试剂法去除鲜艳乳菇多糖中蛋白质的最佳条件为:Sevag试剂配比为正丁醇与氯仿体积比等于1:5,多糖溶液与Sevag试剂体积比为1:2,蛋白质去除次数为5次,在该条件下,多糖中蛋白质去除率为66.24%,多糖回收率为81.44%;采用DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-100凝胶柱层析分级纯化分离得到LVP-0和LVP-1两个鲜艳乳菇多糖纯化组分。(4)高效凝胶渗透色谱、甲基化分析及核磁共振扫描结果表明,鲜艳乳菇多糖LVP-0是一种分子量为23.47 k Da,以→3)-α-L-Fucp-(1→和→6)-α-D-Galp-(1→为主链的链状岩藻半乳聚糖;LVP-1是一种分子量为22.49 k D,以→6)-β-D-Glcp-(1→为主链,在O-3位连有→3)-β-D-Glcp-(1→分支的β-葡聚糖。(5)自由基清除试验表明,LVP-0对ABTS、DPPH、超氧阴离子和羟基自由基的最大清除率分别为72.09、38.27、83.10和57.61%,LVP-1对ABTS、DPPH、超氧阴离子和羟基自由基的最大清除率分别为88.42、55.61、86.97和66.07%;金属离子螯合试验表明,LVP-0对Fe2+和Cu2+最大螯合率分别为36.58和20.43%,LVP-1对Fe2+和Cu2+最大螯合率分别为54.82和36.23%。LVP-0和LVP-1均具有良好的体外抗氧化能力。(6)利用H2O2构建HEK-293细胞氧化损伤模型,评价鲜艳乳菇多糖对氧化损伤细胞的保护作用。试验结果表明,400μM H2O2损伤6 h时HEK-293细胞存活率仅为55.99%,氧化损伤模型构建成功;在25~200μg/m L浓度范围内,LVP-0和LVP-1均不影响HEK-293细胞的正常生长;与氧化损伤模型组相比,LVP-0和LVP-1均能提升损伤细胞存活率,且呈现浓度依赖效应;当浓度为200μg/m L时,LVP-0预处理提升氧化损伤细胞SOD和CAT活力38.92和77.38%,降低ROS和MDA含量36.66和39.58%,LVP-1预处理则提升SOD和CAT活力31.65和61.68%,降低ROS和MDA含量31.38和30.73%。LVP-0和LVP-1均对氧化损伤细胞具有良好的保护作用。(7)以Raw 264.7细胞为模型,评价鲜艳乳菇多糖免疫调节活性。试验结果表明,在25~400μg/m L浓度范围内,LVP-0和LVP-1均不影响Raw 264.7细胞正常生长,但能诱导细胞分化,增强细胞吞噬能力和NO释放量。当浓度为400μg/m L时,LVP-0处理组TNF-α、IL-6和IL-1β分泌量为空白对照组的8.86、10.50和4.69倍,LVP-1处理组TNF-α、IL-6和IL-1β分泌量则为空白对照组的7.20、10.32和3.90倍。LVP-0和LVP-1均具有良好的免疫调节活性。(8)与空白对照组相比,25~1600μg/m L浓度范围内的鲜艳乳菇多糖对S180、A549和He La细胞的存活率无显著影响,鲜艳乳菇多糖无体外肿瘤细胞抑制活性。
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