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目的研究子宫内膜癌特别是低分化子宫内膜样腺癌(the grade 3 endometrioid endometrial carcinoma,G3 EEC)PD-1/PD-L1的表达,探索IFN-γ对G3 EEC及其外泌体PD-L1的影响,为G3 EEC提供相应的更为有效的治疗靶点。方法1.临床水平发现PD-1及PD-L1在G3 EEC中的重要作用:免疫组织化学染色(IHC)检测G1/2 EEC患者50例,G3 EEC患者50例,正常子宫内膜组织50例PD-1及PD-L1的表达情况,并分析其与临床病理参数的相关关系,分析生存预后。2.临床水平发现IFN-γ对G3 EEC及其外泌体PD-L1起到重要作用:(1)使用ELISA法检测G3 EEC 20例,G1/2 EEC 20例及正常对照组20例血清IFN-γ、组织PD-L1、及血清外泌体PD-L1;(2)ELISA法检测G3 EEC术前术后血清IFN-γ及血清外泌体PD-L1差异;(3)Spearman相关性分析:G3 EEC血清IFN-γ与血清外泌体PD-L1。3.细胞水平发现IFN-γ对G3 EEC细胞及其外泌体PD-L1起到重要作用:(1)Western Blot及q PCR检测G3 EEC细胞(KLE)和G1/2 EEC细胞(ISK)PD-L1及其外泌体PD-L1的表达;(2)CCK-8方法确定IFN-γ有效浓度;(3)CCK-8检测IFN-γ对ISK及KLE细胞增殖能力的影响;(4)Western Blot及q PCR检测IFN-γ对ISK/KLE细胞PD-L1及细胞外泌体PD-L1表达的影响。结果1.临床水平IHC结果:(1)PD-1在G3 EEC癌组织的表达高于G1/2 EEC癌组织的表达(P=0.0003),PD-1在G3 EEC癌组织中的表达高于正常子宫内膜组织(P<0.0001)。(2)PD-L1在G3 EEC癌组织的表达高于G1/2 EEC癌组织的表达(P<0.0001),PD-L1在G3 EEC癌组织中的表达高于正常子宫内膜组织(P<0.0001)。PD-1/PD-L1和100例患者的临床病理参数关系进行分析结果显示PD-1/PD-L1的表达水平与年龄,FIGO分期,肌层浸润及淋巴结转移无关;与肿瘤分化程度显著相关(P=0.0009)。生存曲线分析结果显示:(1)在G3 EEC中,PD-1阳性表达的5年生存率为62.32%,PD-1阴性表达的5年生存率为100%,差异有统计学意义(P=0.0410);在G1/2 EEC中,PD-1阳性表达5年生存率为85.71%,PD-1阴性表达的5年生存率为95.45%,差异无统计学意义(P=0.1586)。(2)在G3 EEC中,PD-L1阳性表达的5年生存率为60.46%,PD-L1阴性表达的5年生存率为100%,差异有统计学意义(P=0.0295);在G1/2 EEC中,PD-L1阳性表达5年生存率为85.71%,PD-L1阴性表达的5年生存率为95.45%,差异无统计学意义(P=0.1623)。PD-1及PD-L1在G3 EEC中高表达,且高表达PD-1及PD-L1的G3 EEC患者5年生存率较低。2.临床水平ELISA检测结果:(1)相对于NC,G3 EEC血清外泌体高表达PD-L1(P<0.0001);相对于G1/G2 EEC,G3 EEC血清外泌体高表达PD-L1(P<0.0001);相对于NC,G1/2 EEC血清外泌体高表达PD-L1(P=0.0310)。(2)相对于NC,G3 EEC血清高表达IFN-γ(P<0.0001);相对于G1/G2 EEC,G3 EEC血清高表达IFN-γ(P<0.0001);相对于NC,G1/2 EEC血清高表达IFN-γ(P=0.0020)。(3)G3 EEC术后血清IFN-γ表达明显降低(P=0.0003);G3 EEC术后血清外泌体PD-L1表达明显降低(P=0.0004)。(4)G3 EEC血清IFN-γ与血清外泌体PD-L1为正相关(r=0.9303)。3.细胞水平结果:(1)q PCR发现相对于ISK细胞,KLE高表达PD-L1(P=0.0045);相对于ISK细胞外泌体,KLE细胞外泌体高表达PD-L1(P=0.0098);Western Blot结果也显示KLE外泌体高表达PD-L1。(2)CCK-8分别检测加入不同浓度IFN-γ后KLE细胞的增殖能力结果:当浓度超过200ng/ml后细胞的增殖能力反而会轻度降低,初步确定IFN-γ有效浓度为200ng/ml。(3)48h结果显示:相对于正常KLE细胞,KLE细胞加入IFN-γ48h后,细胞生长加快,细胞增殖加快(KLE+IFN-γ=0.6234±0.01367,KLE=0.3249±0.02151,P<0.0001);72h结果显示:相对于正常KLE细胞,KLE细胞加入IFN-γ48h后,细胞生长加快,细胞增殖加快(KLE+IFN-γ=0.9239±0.00297,KLE=0.5674±0.00341,P<0.0001);差异均具有统计学意义。(4)q PCR发现相对于正常KLE细胞,加入IFN-γ后KLE表达PD-L1明显增高(P<0.0001);相对于正常KLE细胞,加入IFN-γ后KLE外泌体表达PD-L1明显增高(P=0.0006);相对于加入IFN-γ后的ISK细胞,加入IFN-γ后KLE表达PD-L1明显增高(P=0.0002)。Western Blot结果也显示加入IFN-γ后KLE细胞外泌体更高表达PD-L1,加入IFN-γ后ISK细胞外泌体表达PD-L1无明显增高。结论1.临床水平IHC发现PD-1/PD-L1在G3 EEC中起到重要的作用,PD-1/PD-L1在G3 EEC的表达可能是G3 EEC的独立危险因素。2.临床水平发现IFN-γ可能促进G3 EEC血清外泌体PD-L1的表达升高,促进G3 EEC的发展,外泌体PD-L1可能成为G3 EEC新的治疗靶点。3.细胞水平发现IFN-γ促进G3 EEC细胞增殖及其外泌体PD-L1的高表达,可能在G3 EEC的发生中起到重要作用。