论文部分内容阅读
目的：TGF-β促进肿瘤迁移和侵袭。BMPs属于TGF-β家族成员，表达于各种人类肿瘤细胞系中。BMP9是成骨作用最强的成员，我们课题组前期研究发现BMP9过表达可以抑制骨肉瘤细胞的生长和迁移能力，然而，其在骨肉瘤中的作用尚未完全阐明。因此，本研究旨在明确BMP9对骨肉瘤细胞的作用，并探讨其分子机制。方法：RT-PCR检测2株骨肉瘤细胞143B和MG63中BMP2，4，6，7，9及BMP的7个I型受体ALK1-7和3个II型受体BMPRII, ActRIIA和ActRIIB的表达；RT-PCR验证骨肉瘤细胞143B和MG63中AdBMP9和AdsiBMP9腺病毒的有效性；在HEK293细胞中扩增高滴度的腺病毒，将病毒感染骨肉瘤细胞143B和MG63，实验分为5组：AdBMP9，AdGFP, AdsiBMP9, AdRFP, Blank组。MTT检测BMP9对细胞活力的影响，并通过流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况；细胞划痕和Transwell迁移和侵袭实验检测其对细胞迁移和侵袭的影响。RT-PCR和Western Blot检测BMP/Smads相关分子的表达，利用荧光素酶报告基因试剂盒检测BMP9对BMPR-Smad荧光素酶报告质粒p12SBE-luc的启动子转录活性的影响。RT-PCR和Western Blot检测Wnt/β-catenin信号相关分子的表达，制备BMP9条件培养基，先用Adβ-catenin和Adsiβ-catenin处理细胞后，再加入BMP9条件培养基，MTT检测其对143B细胞活力的影响，Transwell迁移实验检测对143B细胞迁移能力的影响及Western Blot检测β-catenin下游分子c-myc和OPG的表达。RT-PCR, ICC和ELISA检测CXCL12/CXCR4生物学轴的影响；RT-PCR及qRT-PCR检测MMP2，MMP7和MMP9的表达，并用明胶酶谱法检测MMP2和MMP9的活性。结果：BMP2，4，6，7，9及BMP的7个I型受体ALK1-7和3个II型受体BMPRII,ActRIIA和ActRIIB均表达于骨肉瘤细胞中，在5种BMP中，BMP9表达最低。BMP9过表达后，在24h显著抑制骨肉瘤细胞活力，在48h和72h抑制作用更明显，而BMP9沉默后仅在48h显著促进骨肉瘤细胞活力(P <0.05)。BMP9过表达降低划痕愈合率和减少骨肉瘤细胞迁移细胞数目，在143B和MG63细胞中，迁移细胞数目分别从AdGFP组的(170±19.1)个和(64±7)个降至AdBMP9组的(98±12.9)个和(40±4.5)个(P <0.05)，BMP9过表达减少骨肉瘤细胞侵袭细胞数目，在143B和MG63细胞中，分别从AdGFP组的(16.3±0.9)和(13±1.2)个降至AdBMP9组的(9±1.8)和(6.3±0.8)个(P <0.05)，而沉默BMP9后呈现相反的作用。BMP9过表达后使骨肉瘤细胞143B和MG63的S期百分率分别从AdGFP组的(59.32±5.16)%和(42.75±4.69)%降至AdBMP9组的(39.07±4.16)%和(9.41±3.82)%(P <0.05)，而G0/G1期百分率分别从AdGFP组的(31.14±3.29)%和(43.36±3.11)%增加到AdBMP9组的(47.83±4.66)%和(82.65±3.68)%(P <0.05)。BMP9过表达后，在48h促进143B细胞凋亡，从AdGFP组的(10.23±2.61)%增加到AdBMP9组的(19.91±2.29)%(P <0.05)。而在MG63细胞中，与AdGFP组相比，AdBMP9处理48h后，细胞凋亡率没有显著增加(P>0.05)。BMP9过表达激活BMP/Smads信号通路，增加了Smad1/5/8的磷酸化水平(P <0.05)，上调其下游靶基因ID1mRNA的表达，而BMP9沉默后呈现相反作用(P <0.05)。在143B和MG63细胞中，BMP9过表达后BMPR-Smad荧光素酶报告基因启动子的活性分别增加了2.9倍和2.1倍(P <0.05)。BMP9过表达后可以抑制β-catenin的表达，并抑制其下游基因c-myc和OPG的表达，而BMP9沉默后呈现相反作用。BMP9过表达后p-GSK-3βSer9表达量减少，而BMP9沉默后可以逆转其作用。β-catenin过表达可以减弱BMP9对细胞活力、迁移能力和c-myc和OPG表达的抑制作用，而β-catenin沉默后可以进一步增加其抑制作用。CXCR4表达于143B和MG63细胞中，而CXCL12只表达于MG63细胞，BMP9对CXCL12/CXCR4生物学轴没有影响；BMP9过表达后可以减少MMP9的mRNA水平和活性(P <0.05)，BMP9沉默后呈现相反作用。而对MMP2和MMP7的mRNA水平和MMP2的活性没有影响(P>0.05)。结论：BMP9过表达可以抑制骨肉瘤细胞生长和迁移侵袭能力，可能是通过激活BMP/Smads信号通路和抑制Wnt/β-catenin信号通路并减少MMP9的mRNA水平和活性来实现的，而与CXCL12/CXCR4生物学轴无关。