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脱卤酶是催化碳卤键断裂的一类酶,可用于合成制备医药、农药中间体,如D-乳酸、S-2-氯丙酸、D-2,3-二氯丙酸等。因此选择具有代表性的S-2-氯丙酸、羟基乙酸和3-羟基丙酸为模型化合物,研究卤代酸脱卤酶的催化特性和规律,具有重要的理论意义和应用前景。论文首先通过高通量筛选法分别获得产R-2-卤代酸脱卤酶,氯乙酸脱卤酶和3-氯丙酸脱卤酶的菌株,然后采用简并PCR-染色体步移法或基因组文库法获得基因,构建了能高效表达的重组菌,最后结合分子模拟研究脱卤酶的催化特性,具体研究内容如下：1)通过高通量筛选法,获得产R-2-卤代酸脱卤酶的假单胞菌ZJU26(Pseudomonas sp.ZJU26).利用简并PCR和染色体步移法获得N端缺失的R-2-卤代酸脱卤酶的基因片段(dehDIV).添加来自恶臭假单胞菌AJ1/23的R-2-卤代酸脱卤酶基因(hadD)的N端序列(24个氨基酸残基)到dehDIV获得了新的脱卤酶基因(dehDIV-R).将dehDIV-R亚克隆到pET30a(+)载体中,在E. coli BL21(DE3)中实现高效表达,获得了重组的R-2-卤代酸脱卤酶(rDehDIV-R).其酶学性质为：最适pH 9.0,最适反应温度60℃,Km为2.245 mM,酶比活为20.56 U/mg。以纯化后的rDehDIV-R为催化剂,催化100mM 2-氯丙酸,4h内转化率达50.5%,ees>99%。以已知结构的RS-2-卤代酸脱卤酶(PDB编号为3BJX)为模板,同源模建了DehDIV-R的三维结构。对接结果表明R-2-氯丙酸以较低能量结合到酶的活性位点上,决定其选择性的是位点Asn203。利用分子模拟的氨基酸突变功能将Asn203突变成不同空间位阻的氨基酸,结果显示Asn突变成空间位阻较小的丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)时酶活上升,立体选择性丧失；但突变成空间位阻更大的Gln时,可能由于Gln的羧基的氢键作用,使酶对S-2-CPA亲和力增加,导致活力和立体选择性都下降。该结果说明了Asn203在酶的对映体选择性的作用。2)采用高通量筛选获得高产氯乙酸脱卤酶的菌株假单胞菌CGMCC 3267 (Pseudomonas sp.CGMCC 3267).活性电泳显示该酶为S-2-卤代酸脱卤酶。利用S-2-卤代酸脱卤酶的高保守性部位设计引物,通过简并PCR获得了氯乙酸脱卤酶的基因(dehll-S).将dehll-S亚克隆到pET30a(+)载体上,在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)实现高效表达,获得了重组的氯乙酸脱卤酶(rDehⅡ-S).其酶学性质为：最适pH 9.5,最适反应温度为50℃,Km为0.97 mM,酶比活为10.3 U/mg。利用原始菌的Dehll-S、重组菌的rDehⅡ-S的粗酶液为催化剂,以氯乙酸为底物,获得的羟基乙酸纯度>99%。为了减轻反应过程中的Cl抑制问题,采用添加镁铝氧化物吸附C1-去来降低溶液中C1-的浓度。在优化的条件下：200 mM氯乙酸,添加0.02g/L镁铝氧化物,反应15h,转化率>99%,产物纯度>99%。同源模建获得了DehⅡ-S的三维结构。三维结构比对发现该酶的催化口袋较大范围暴露在溶剂中,决定其具有较快的催化速度,较广的底物范围。采用分子对接手段来研究酶的底物选择性。结果发现直链S-2-卤代烷酸(从氯乙酸到S-2-十八烷酸)可以结合到DehⅡ-S,且结合能随着碳链的增长而增加。但由于碳链的增长,可能会占据Arg41催化氯离子离去的通道,使酶活力下降。3)通过高通量筛选获得能够降解高浓度3-氯丙酸和3-氯丁酸的菌株芽孢杆菌CGMCC 4196(Bacillus sp.CGMCC 4196).代谢产物的定性定量分析证明了该脱卤机理为水解型。构建基因组文库筛选到阅读框大小为465bp的3-氯丙酸脱卤酶基因(dehⅢ)将dehⅢ亚克隆到pET30a(+)载体,在含有稀有密码子补充的宿主菌E. coli BL21codon plus(DE3)里有效表达,获得了重组3-氯丙酸脱卤酶(rDehⅢ).其酶学性质为：最适pH为7.0,最适反应温度为30℃,Km为3.213mM,酶比活为19.28 U/g。利用纯化的rDehⅢ为催化剂,催化3-氯丙酸水解脱卤制备3-羟基丙酸,产率>99%。以脯氨酸羟化酶(Tpal)为模板,得到DehⅢ的三维结构。利用SiteID及Surlex-Docking预测该酶的催化位点为Asp55, Arg77, Arg78等。