论文部分内容阅读
背景副溶血性弧菌是引起全球食物中毒的重要致病菌,1996后出现的由副溶血性弧菌引起的食物中毒爆发,可能是由‘大流行菌群’引起。同本学者在2003年完成了副溶血性弧菌大流行菌株RIMD2210633的全基因组序列的测定。本研究目的是通过基因芯片技术,针对大量具有代表性的全球性副溶血性弧菌菌株进行基于芯片的比较基因组学研究,以深入认识副溶血性弧菌基因组多态性和种群的系统发育。方法利用副溶血性弧菌全基因组序列,挑选出4770条基因,PCR扩增各基因并将PCR产物纯化,点样制备芯片。设计了两个质控杂交组合,采用双色荧光杂交策略,对芯片质量进行评价,并用PCR方法验证部分芯片结果。针对174株副溶血性弧菌,进行基于芯片的比较基因组学研究。用原核表达系统构建副溶血性弧菌几种重要毒力相关基因的表达载体。结果成功的研制了一批副溶血性弧菌全基因组DNA芯片。经质量评价,发现芯片杂交与理论预期结果以及PCR验证结果完全一致,证明此芯片质量良好,可以用于后续的比较基因组杂交。建立了基于DNA芯片的副溶血性弧菌比较基因组学技术平台,建立了一套系统的芯片数据分析的标准方法。成功构建了六种重要毒力相关基因的原核表达载体,为以后深入研究副溶血性弧菌致病机制打下物质基础。我们对174株菌的芯片数据进行了系统进化分析后,得到了174个菌株的种系结构图——最小生成树。174株菌被分为了5个群(C1至C5),每个群内的个体在种系发生和遗传学上彼此密切相关。C3和C4代表高毒的临床克隆株,而C5群和无毒的环境分离株高度相关。C2和C3分别组成了两个不同的克隆群——‘旧03:K6克隆群’和‘大流行菌群’。c3包括了所有经PCR验证为大流行菌株的39个菌株(trh~-,tdh~+和GS-PCR~+),C2则包括了12株1996前的旧03:K6菌株(trh~+,tdh和GS-PCR~-)。大流行菌群f,1996后‘新’03:K6和它的衍生菌株04:K68,O1:K25,01:KUT和06:K18)是由旧O3:K6克隆进化而来,进化过程包括toxRS/新序列的出现和基因组岛的逐步获得。研究还发现了介于大流行菌群和旧O3:K6克隆群之间的一个种系发育的‘中间型O3:K6进化枝’(trh~-,tdh~- and GS-PCR~+)。174株菌的差异组成的基因占全基因组总数的22%。结论通过大量菌株的基于芯片的比较基因组学研究,获得了这些菌株的基因组成概况、种群结构和大流行菌群的进化史。