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研究背景:卵巢低反应(poor ovarian response,POR)是体外授精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)治疗女性不孕过程中经常遇到的问题。很多不孕女性在超促排卵时对临床促排卵药物不敏感,导致排卵药物使用剂量增加、临床获卵数减少,优质胚胎率降低。因为卵巢低反应患者获卵数少、卵子质量下降,所以卵巢低反应患者辅助生殖治疗的结局往往是周期取消率高、临床妊娠率低。高龄女性群体易发生卵巢低反应,是因为卵巢储备能力随着年龄增加而降低,但随着现代社会生活节奏的加快以及生活压力的增加,卵巢低反应的发生越来越年轻化,成为女性不孕不育治疗中一个不容忽略的重要问题。然而,目前对于卵巢低反应疾病的发病机制还不是很清楚。方法:1,低龄卵巢低反应组、高龄卵巢低反应组、正常对照组卵泡液miRNA高通量测序及部分验证:我们纳入了2015年4月-2016年4月在上海交通大学医学院附属仁济医院生殖医学中心实施IVF/ICSI超促排卵方案治疗的POR患者30例和非POR患者15例,其中,30例POR患者中,年龄大于40岁(高龄卵巢低反应,PORO)患者15例,年龄25岁-35岁(低龄卵巢低反应,POR-Y)患者15例,收集取卵日直径大于18mm的成熟卵泡的卵泡液样本,进行优势卵泡液的分离、冻存和颗粒细胞的提取、冻存。选取POR-Y,POR-O,NC组中各3例患者的2ml优势卵泡液进行miRNA提取,并进行高通量测序分析(miRNA-Sequencing)。通过扩大样本量,用RT-PCR方法对高通量测序结果进行验证。2,miRNA-15a-5p影响卵巢低反应患者卵泡发育的具体作用机制:我们采用人卵巢颗粒细胞和细胞模型-卵巢颗粒细胞系KGN的体外实验来研究miRNA-15a-5p的具体作用机制,首先用临床低龄卵巢低反应患者的颗粒细胞,通过反转录-实时荧光定量PCR的方法检测PI3K-AKT-m TOR相关基因、BCL2、BAD mRNA水平上的改变情况,然后用人卵巢颗粒细胞系KGN作为细胞模型,外源性转进miRNA-15a-5p mimic和miRNA-15a-5p inhibitor,通过RT-PCR及Western Blot等实验方法来检测PI3K-AKT-m TOR相关基因、BCL2、BAD mRNA及蛋白的改变情况。结果:1,低龄卵巢低反应组、高龄卵巢低反应组、正常对照组卵泡液miRNA高通量测序及部分验证:高通量测序结果是,我们得到1258个有差异表达的miRNAs。与NC组比较,POR-Y组中显著上调miRNAs有7个,显著下调miRNAs有32个;POR-O组中有24个显著上调表达的miRNAs,21个显著下调表达的miRNAs。在这些有差异的miRNA中,我们首先筛选出4个miRNA进行扩大样本量验证,分别是miRNA-15a-5p、miRNA-483-5p、mi R-199a-5p与mi R-885-5p。通过36例卵泡液样本和颗粒细胞样本验证,我们发现,miRNA-15a-5p与miRNA-483-5p与测序结果是一致的,即与对照组NC比较,miRNA-15a-5p在POR-Y组中表达显著上升,在POR-O组中表达差异无显著性。miRNA-483-5p在POR-Y组中表达显著下降,而在POR-O组中表达差异无显著性。mi R-199a-5p与mi R-885-5p两个miRNA的表达在POR-Y与POR-O两组均没有显著性差异。2,miRNA-15a-5p影响卵巢低反应患者卵泡发育的具体作用机制:与正常对照组相比,在低龄卵巢低反应患者颗粒细胞中,与细胞增殖过程相关的AKT,m TOR,S6K1 mRNA水平表达显著下降,miRNA-15a-5p的靶基因-抗凋亡基因BCL2表达显著下降,而促凋亡基因BAD表达明显增强。另外miRNA-15a-5p在体外细胞转染实验中,无论是RNA水平还是蛋白水平,我们都证实,miRNA-15a-5p对与细胞增殖过程密切相关的经典通路PI3K-AKT-m TOR通路有抑制作用,具体结果是:与miRNA-15a-5p negative control对比,miRNA-15a-5p mimic转染细胞后,在mRNA水平上,AKT,m TOR,S6K1表达显著下降,BCL2 mRNA水平表达显著下降,BAD mRNA水平表达明显增强;与低龄卵巢低反应患者颗粒细胞检测结果相一致;蛋白水平上,p-m TOR,p-S6K1,p-4EBP1蛋白表达显著降低,靶基因BCL2蛋白表达显著下降,与相应基因mRNA水平上变化是相一致的。m TOR蛋白水平没有差异性,但the p-m TOR/m TOR比值显著下降,miRNA-15a-5p inhibitor转染细胞实验结果相反。结论:本研究通过miRNA高通量测序发现了在卵巢低反应患者的卵泡液中存在众多表达有显著性差异的miRNAs,特别是低龄卵巢低反应患者,高水平表达的mi R-15a-5p,可能会通过PI3K-AKT-m TOR通路来影响卵细胞和卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡过程,参与低龄卵巢低反应疾病的发生。