论文部分内容阅读
乳糖酶(lactase),学名 β-D-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase,EC3.2.1.23),催化乳糖水解作用,将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖,或发生转糖苷反应生成低聚半乳糖。目前乳糖酶在制备低乳糖牛乳制品等方面广泛应用,可以有效地降低乳糖不耐受症。其中来源于乳酸菌的乳糖酶为中性乳糖酶,安全性较高,最适催化温度介于40℃～60℃之间,可满足生产乳制品的要求,但其不能分泌到胞外,分离纯化的难度很大,给大规模生产带来困难。因此本文对来自于乳酸菌的乳糖酶基因导入毕赤酵母中进行克隆于表达。本文对来自乳酸菌产马乳酒乳杆菌ZW3(Lactobacillus kefiranofaciens ZW3)的乳糖酶基因LacLM进行生物信息学分析,该基因全长2833bp,可编码由948个氨基酸组成的蛋白,其编码的β-D-半乳糖苷酶为一疏水性蛋白,其中大亚基LacL全长1887bp,可编码628个氨基酸,其中小亚基LacM全长963bp,可编码320个氨基酸,大小亚基有17bp的重叠序列,大小亚基都不含信号肽,均属于非分泌型胞内蛋白。本文又探索了以马乳酒样乳杆菌ZW3基因组编码的乳糖酶基因在毕赤酵母中进行克隆表达。以马乳酒样乳杆菌ZW3基因组为模板,PCR扩增得到LacL、LacM两个乳糖酶大小亚基片段,分别经EcoR I和SnaB I双酶切后,分别连接pPIC9K质粒,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并验证其核苷酸序列正确无误。将重组质粒pPIC9K-LacL、pPIC9K-LacM分别电转入毕赤酵母 GS115,构建 pPIC9K-LacL-GS115重组子和pPIC9K-LacM-GS115重组子,通过筛选抗G418浓度达到3.0mg/mL的菌株,得到了具有多拷贝基因的重组子。pPIC9K-LacL-GS115重组子经反转录PCR验证,cDNA上存在LacL片段,并可检测到乳糖酶酶活性为1.17U/mL。pPIC9K-LacM-GS115重组子诱导表达120h后,其发酵液上清经SDS-PAGE蛋白电泳检测到目的条带,但没有表现乳糖酶活性。通过对毕赤酵母pPIC9K-LacL-GS115重组子摇瓶条件下的培养条件优化,乳糖酶酶活最高达到了1.44 U/mL,比优化前提高了23%。