【摘 要】
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目的 PCR扩增人端粒酶催化亚单位(hTERT)的核心启动子序列,将其克隆入荧光素酶报告载体pGL3Basic和含有SV40增强子的pGL3Enhancer中,以比较hTERT启动子与hTERT启动子联合
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目的 PCR扩增人端粒酶催化亚单位(hTERT)的核心启动子序列,将其克隆入荧光素酶报告载体pGL3Basic和含有SV40增强子的pGL3Enhancer中,以比较hTERT启动子与hTERT启动子联合病毒SV40增强子即hTERT-SV40嵌合启动子系统在端粒酶阳性的恶性肿瘤细胞株和端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株中转录活性和特异性的差异,试图通过SV40增强子来增强hTERT启动子的转录活性,同时不改变其肿瘤特异性,以便为恶性肿瘤的靶向性治疗提供初步的理论基础和实验依据。 方法 以人基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增端粒酶逆转录酶基因5’端上游长260bp的核心启动子片段,后将其亚克隆入pGEM-T Easy载体,构建载体pGEM-hTP,其经酶切和DNA测序无误后,使用限制性内切酶Kpn Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切pGEM-hTP载体,得到hTERT核心启动子片段,将其与同样经Kpn Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切消化的荧光素酶报告载体pGL3-Basic和pGL3-Ehancer进行连接,构建pGL3-hTP和pGL3hTP-SV40重组质粒;使用磷酸钙转染系统,将pGL3-hTP、pGL3-hTP-SV40、pGL3-Control和pGL3-Basic质粒分别与pRL-TK共同转染HT-29、SW620、MGC-803等端粒酶阳性的恶性肿瘤细胞株和人胚肺成纤维正常细胞株MRC5中,其中pGL3-Basic为阴性对照,pGL3-Control
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