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目的分析GII-4型诺如病毒广州株GZ20133135全基因组序列,了解其基因结构的特点以及基因组类型。应用分子生物学手段制备GII-4型No V P粒子,通过酶免疫分析试验(Enzyme immune assays,EIA)为基础的唾液结合实验和寡糖结合实验分析我国主要基因型95/96 US株、2006b株、Sydney株等3种毒株与组织血型抗原(Histo-blood group antigens,HBGAs)的相关性,以获得我国No V流行株与HBGAs的结合模式,从而确定诺如病毒流行株感染的宿主范围,为进一步研究No V与宿主受体之间的关系及No V疫苗和防治药物的研发提供实验基础和理论依据。方法1诺如病毒广州株GZ20133135全基因组序列测定及分析:依据Sydney2012全基因组参考株进行引物的设计,用RT-PCR分段的方式对诺如病毒全基因组进行扩增,经过分子克隆的手段、测序以后再进行系统的进化分析。2制备GII-4型诺如病毒P粒子:选择Sydney2012代表株3135,通过基因工程方法构建表达质粒p GEX4T1-P,将鉴定正确的p GEX4T1-P质粒转化BL21(DE3)感受态菌,挑选单克隆菌落小量表达,SDS-PAGE鉴定是否有融合蛋白产生。随后将保存菌种活化进行目的蛋白的大量表达,利用琼脂糖-4B柱对P蛋白进行纯化并通过凝血酶除去GST融合蛋白标签以形成二十四聚体的P粒子。3分析不同型别诺如病毒株与组织血型抗原的亲和性:利用ELISA唾液结合实验分析3个型别的诺如病毒流行株与唾液中的HBGAs受体相结合的情况。利用HBGAs表型已明确的54份唾液样本包被96孔酶标板,加纯化的No V P粒子与之反应,以相应的鼠抗GII-4 No V P血清为一抗,二抗为HRP标记的山羊抗鼠Ig G,加入TMB显色液,在酶标仪上的450nm波长处显示的OD值。通过3个毒株的P蛋白对lea、leb、lex、ley、A、B、H1和H2型寡糖进行EIA为基础的寡糖结合实验。综合唾液结合及寡糖结合的实验分析三个诺如病毒流行株与HBGAs受体的结合方式。结果1诺如病毒广州株GZ20133135全基因组序列测定及分析:GII-4型诺如病毒广州株GZ20133135病毒基因组全长7566bp,其病毒基因组分为三个开放阅读框(ORFs),ORF1、ORF2及ORF3长度分别为5100bp、1623bp和807bp,ORF1与ORF2之间有19个核苷酸重叠。广州株GZ20133135全基因组的序列与参考株GII-4型Sydney2012变异株序列的同源性最高,全长同源性为99.07%。通过系统的进化分析表明,广州株GZ20133135株属于GII-4 Sydney2012的变异株。通过对衣壳区541个氨基酸比对,Sydney2012变异株位点变化情况为:aa294 V或A或P→T,aa296 S或T→S,aa297H或Q→R,aa298D或N或T→N,aa368 T或N或S或A→E,aa372 N或S→D,aa393 N或D或S,aa394 T或G或S→T,aa395 T或A→T,aa407 N或D→S,aa412 T或D→N,aa413 G或I→T。2制备GII-4型诺如病毒P粒子:PCR扩增得到3135 P区序列,大小都为991bp。成功构建表达质粒4T1-3135 P,测序结果证实连接的表达片段长为972个核苷酸,编码324个氨基酸。SDS-PAGE电泳分析证实成功表达了分子量约62k Da的可溶性的GST-P融合蛋白和分子量为36k Da的目的蛋白P蛋白。3分析不同型别诺如病毒株与组织血型抗原的亲和性:通过P蛋白的唾液结合实验分析得到3135-P、9711-P和55019-P诺如病毒与唾液HBGAs的结合模式。9711及55019株的P粒子与A、B、AB、O+型唾液能够结合,而与O-型唾液则均不结合。3135株P粒子与A、B、AB、O+、O-型唾液均结合。通过寡糖结合实验发现3135与lea、leb、A、B、H2型结合;55019与leb、ley、A、B、H2型寡糖结合;9711与leb、ley、A、B型寡糖结合。结论1广州株GZ20133135株属于GII-4 Sydney2012变异株;2成功构建诺如病毒表达质粒4T1-3135 P,并获得目的蛋白P粒子;3 HBGAs与3135、9711和55019 GII-4型No V的结合呈现毒株特异性。由唾液及寡糖结合实验综合分析发现9711株及55019株的P粒子与A、B、AB、O+血型唾液能够结合,与O-血型唾液则均不发生结合。3135株P粒子与A、B、AB、O+、O-血型唾液均结合。