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2002年末始发于中国广东省的非典型肺炎（infectious atypical pneumonia，），随后也被称为严重急性呼吸综合征（The severe acute respiratory syndrome，SARS），具有高度传染性与致病性。疫情于2003年2月传播至香港，随后迅速向全球各地蔓延。其致病因子于2003年3月被鉴定为一种新的冠状病毒，被命名为SARS冠状病毒（SARS-CoV）。冠状病毒是一类球形、有包膜的病毒，基因组为长约30 kb的单股正链RNA，主要引起人和动物的呼吸道与肠道疾病。SARS-CoV的基因组结构为：5′-帽状结构-复制酶（rep）-刺突糖蛋白（S）-小包膜蛋白（E）-膜糖蛋白（M）-核衣壳蛋白（N）-polyA尾-3′。本研究用大肠杆菌表达出了SARS-CoV的结构蛋白及3CLpro蛋白，检测了SARS恢复期患者血清中的抗体情况，构建了S与N蛋白的DNA疫苗，进行了小鼠免疫试验，并筛选出了数段可特异阻断S、N基因表达的小干扰RNA（siRNA）。该系列研究对于了解SARS-CoV的免疫学特点及为发展SARS-CoV感染的防治方法有一定参考意义。 一、SARS-CoV结构蛋白在大肠杆菌中的表达和对SARS恢复期血清中抗体的分析 扩增SARS-CoV的结构蛋白S、N、M、E蛋白基因与蛋白酶3CLpro基因。其中S基因被分为4段分别扩增，S300（14～313 aa）、S240（301～540 aa）、S338（557～894 aa）和S324（867～1190 aa）。M基因另被分为两段分别扩增，MN（1～110aa）和MC（111～221 aa）。分别将这些基因片段插入原核表达质粒载体pPROEX HT、pBV220、pET21a与pGEX-4T-1，转化到合适的大肠杆菌，用IPTG或加热培养基的方法诱导目的基因的表达。菌体样品进行SDS-PAGE分析，随后用两份抗SARS-CoV IgG强阳性的SARS恢复期混合血清对表达产物进行Western Blot分析。结果表明，S300、S240、S338、S324、N、MC、E及3CLpro表达质粒均可在大肠杆菌表达出与预测分子量一致的蛋白分子。其中，N蛋白与SARS恢复期血清的反应最强，S蛋白次之，四段S蛋白中，S300的反应最强，S240与S338的反应强度相似，随后为S324。MC蛋白的反应较弱，E、3CLpro蛋白则未见明确的反应条带。该结果在一定程度说明，SARS-CoV的N蛋白具有强抗原性，随后则是S与M蛋白，而S蛋白的主要抗原决定簇位于该蛋白的氨基末端。 用Ni-NTA树脂分别纯化大肠杆菌表达的S300、S240与N蛋白，包被酶联板，以ELISA检测临床确诊的18份SARS患者恢复期血清，其中17份血清抗N蛋白IgG阳性，14份血清抗S300 IgG阳性，10份血清抗S240 IgG阳性。结果进一步表明，N、S蛋白对于SARS-CoV感染的诊断具有重要意义。由于S蛋白的中和抗体表位主要位于其氨基端，而S240是涉及SARS-CoV病毒体与其受体血管紧张素转化酶Ⅱ结合的关键多肽，因此，血清中S300、S240抗体的检测结果表明S蛋白体液免疫应答在SARS-CoV感染者存在不均一性，也提示S蛋白抗体在SARS恢复中的作用值得进一步研究。 二、S、N蛋白基因疫苗在小鼠的免疫试验 用哺乳动物优势密码子合成S基因1～751 nt，分别用绿色荧光蛋白表达质粒pEGFPN1为载体检测合成的序列与相应的野生序列的表达效率，结果表明密码子优化可明显提高该基因的表达水平。用PCR分别拼接、扩增得到S基因1～2058 nt的DNA片段和S基因1913～3768 第二军医大学博士学位论文 袱ni的DNA片段，利用S基因第1924位的Sa几酶切位点，将两片段连接为3768ni的全长S基因.再利用S基因第750ni的Pstl酶切位点，将合成的S基因1一75 Ini片段置换到全长S基因中.将密码子部分优化的全长S基因插入真核表达质粒载体，构建成表达质粒PCIDN一mFS。将该质粒肌肉注射接种BALB/c，卜鼠，剂量100林留只，二周一次，共3次。分别以大肠杆菌重组5300、5240及SARS一 CoV全病毒抗原检测小鼠血清中的杭SARS一CoVIgG抗体。结果表明，S基因DNA疫苗能在小鼠有效诱导杭SARS一Cov IgG特异性抗体，三次免疫后的小鼠杭体阳转率达75%。结果还发现，S蛋白不同区段多肤刺激的体液免疫应答存在明显的异质性，提示诱导全面的S蛋白杭体是研究SARS疚苗需要关注的问题. 将N基因插入真核表达质粒载体pcl一ne。，得到重组表达质粒pCI一N，转染COsl细胞，细胞裂解液进行westem Blot分析，表明该质粒能表达N蛋白.将质粒pcl一N肌肉注射接种BALB/。小鼠，检测小鼠血清中的N蛋白IgG抗体，用重组N蛋白体外刺激小鼠脾细胞，检测其增殖反应及分泌的细胞因子IFN一Y与IL一4.结果表明，N蛋白DNA疫苗可有效诱导特异性杭体与T淋巴细胞免疫应答，脾细胞分泌的细胞因子及杭体亚类的分析还表明，N蛋白诱导的免疫应答属于Thl型。结果提示，N蛋白是有效的T淋巴细胞免疚原，其诱生的细胞免疫应答对于杭SARS一CoV复制及促进S等包膜蛋白的杭体反应可能均起重要作用，因此，联合N蛋白可能提高SARS疫苗的保护效果.三、杭SARS一COV小干扰RNA的筛选和功能鉴定 分别设计四段靶向N基因及两段靶向S基因的小干扰RNA（small interference RNA，siRNA），用PCR合成编码小鼠U6 RNA聚合酶启动子调控的siRNA表达框架.将PCR合成的siRNA表达框架与N及S一EGFP融合基因表达质粒共转染COSI细胞，观察细胞内绿色荧光的变化。结果发现