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杆状病毒编码的几丁质酶基因(ChiA)为晚期表达基因，主要在感染后期参与降解虫体表皮中的组成型几丁质，促使虫体液化从而促进病毒的水平传播，杆状病毒ChiA基因的缺失与否直接影响杀虫速度。本论文对HaSNPV ChiA基因缺失信号肽的编码区(ChiAS~-)在大肠杆菌中和昆虫细胞中分别进行了表达；并对BmNPV几丁质酶基因进行了缺失和功能分析，为杆状病毒分子生物学的深入研究和BmNPV表达系统的修饰以及几丁质酶作为生物杀虫剂增效剂的研制提供依据。 1．HaSNPV几丁质酶基因在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达及其表达产物对Bt制剂的杀虫增效作用 PCR扩增出不含N末端信号肽编码序列的HaSNPV ChiAS~-基因片段，并分别克隆至原核表达载体pET28a和重组到杆状病毒Bac to Bac表达系统，在大肠杆菌(Eschechia coli)BL21和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞系Tn-5B1-4中分别进行了表达。在大肠杆菌表达量约占细菌总蛋白的15％，在昆虫细胞中表达量约占细胞总蛋白的8.3％。将含有几丁质酶的大肠杆菌和昆虫细胞表达产物添加到Bt菌液中一起喂食2龄家蚕，结果显示HaSNPV几丁质酶基因的两种表达产物和Bt杀虫剂的混合物对处理的家蚕的致死时间较对照处理均明显缩短。昆虫细胞和大肠杆菌表达产物与Bt混合物处理的LT50分别从93.5h和95.1h缩短到56.2h及67.2h。并且供试家蚕的生长速度明显缓慢。因此，HaSNPV几丁质酶有望用于作为Bt杀虫剂的增效剂。 进一步对HaSNPV ChiAS~-大肠杆菌表达产物进行SDS-PAGE分析表明，表达产物主要存在于包涵体中。采用超声波破菌，溶菌酶破菌，高速离心反复洗涤获得包涵体；SDS-PAGE及扫描分析目的蛋白占不可溶总蛋白的30％。用Ni-NTA树脂对包涵体纯化后可获得纯度在90％以上的ChiAS~-。用纯化的HaSNPV ChiAS~-作抗原免疫家兔，制备了兔抗HaSNPV几丁质酶多克隆抗体。 将PCR扩增出的HaSNPV ChiAS~-基因克隆至含绿色增强蛋白(EGFP)基因的供体质粒pFastBacHTe中，在杆状病毒Bac-to-Bac表达系统中与egfp进行了融合表达，荧光显微镜下可以观察到感染细胞发出强烈的绿色荧光，并产生分子量约为90 kDa的特异性表达条带，重组Bacmid感染的Tn-5B1-4细胞中荧光主要分布在细胞质内。 2．BmNPV ChiA基因功能分析 将egfp基因、BmNPVChiA基因上游1550 bp及下游1500 bp的片段，依次克隆到pSK+载体中，浙江大学博士学位论文构建缺失Ch沮基因的转移载体pEGFP/Ch认一。通过将转移载体pEGFP/Ch认一DNA和野生型BmNPv基因组DNA共转染得到了已劝基因取代了Ch“基因的重组BmNpv(rBmEGFP/ch认一)。rBmEGFP/Ch认一感染家蚕细胞后sh用肉眼可以观察到荧光，感染后48h荧光达到最强，并一直维持在这个水平直到细胞浮起。表明Ch认基因属于晚期基因，其启动子能够驱动外源基因的表达，缺失以后并不影响病毒的正常复制。本文还就Ch沮基因缺失对多角体的影响进行了分析，结果表明野生BmNFPV感染的细胞在感染后第4天开始裂解，感染后第7天有大量多角体释放到培养基中;而rBmEGFP/Ch认一感染的家蚕细胞在感染后第7天细胞仍基本不裂解，只有极少量的多角体被释放到培养基中。野生BmNPV感染的家蚕在发病时就开始液化，死亡后体壁立即变黑并完全液化，rBmEGFP/Ch认一感染的家蚕出现症状时间推迟，其感染的幼虫发病后表皮完整，在死亡后7天仍不酶解液化。 将转移载体pEGFP/ChiA‘DNA和家蚕可线性化病毒BmBacPAK6基因组DNA共转染构建了e加基因取代了ChiA基因的重组BmBacPAK6病毒(B mElaCz十Ch“一)，并就BmNPv-昆虫细胞表达系统中Ch胡基因缺失对多角体蛋白基因启动子控制之下的lacZ基因表达量的影响进行了鉴定。SDS一队GE薄层扫描分析显示，感染后3天和4天，BmElacZ十Ch认一感染细胞中的尽半乳糖昔酶的表达量占细胞总蛋白的6.9%和7.7%，而在BmBacPAK6中分别为3.2%和4.2%。同时，刀一半乳糖昔酶活性和相应对照相比分别增加了2倍和1，5倍。以上结果表明Ch沮基因缺失在BmNPV-昆虫细胞表达系统中能导致外源基因表达量的提高。虫试结果表明BmElacz+Ch沮一和BmBac队K6感染的幼虫血淋巴中如乙Z基因的表达量无明显的差异，但是Ch叼基因的缺失在家蚕体内能导致刀一半乳糖昔酶被检测到的活性的降低，BmElacZ+Ch沮一感染家蚕后第4天蚕体匀浆物上清和血淋巴中刀一半乳糖昔酶活性分别比对照(BmBac队K6)降低了116%和174%。4.Ch“相邻基因lef7基因的克隆和表达 BmN’Pv lef7基因序列分析表明，lef7基因全长684bP，由227个氨基酸组成，可编码预计分子量为26盼a的多肤。起始密码子ATG位于几丁质酶基因编码框内，在起始密码子ATG上游·16 bp处有杆状病毒早期基因启动子典型的转录起始位点元件CAGT，在起始密码子ATG下游十46 bp处还有一个ATG密码子(与AcMNpV lef7起始密码子ATG位置相同)，因此lef7基因可能从第二个ATG密码子开始翻译，为了进一步明确ChiA基因缺失对leP7基因表达的影响，本文对lef7基因进行了克隆和表达。 从BmNPV基因组中PCR扩增出lef7基因，并克隆到原核表达载体PGEM一4T-2中进行融合表达，表达的GST融合蛋