对胶质瘤干细胞微环境的研究因缺乏合适的肿瘤模型而进展有限。本文通过3D生物打印技术体外建立胶质瘤干细胞的3D肿瘤模型，初步对比研究3D生物打印肿瘤模型和2D模型的化疗药物敏感性；通过改进的生物打印方法建立壳-芯结构肿瘤细胞线，用转染LOXP-STOP-LOXP-RFP基因的胶质瘤干细胞（GSCs）和转染CRE酶的人骨髓间充质干细胞（hMSCs）的肿瘤模型研究胶质瘤干细胞与骨髓间充质干细胞之间的作用关系；通过增强型绿色荧光蛋白（EGFP）裸小鼠和骨髓损毁重建嵌合体裸小鼠（仅骨髓来源细胞表达EGFP）模型，建立双色荧光示踪的颅内原位移植肿瘤模型，从移植瘤中分选宿主骨髓间充质干细胞（BMSCs），进一步验证 BMSCs的生物学特征。　　第一部分：体外3D生物打印脑肿瘤模型　　目的：通过3D生物打印的方法建立体外3D脑肿瘤模型，评估3D生物打印胶质瘤干细胞体外建立脑肿瘤模型的可行性；初步对比3D生物打印胶质瘤模型和2D培养模型的生物学特征和化疗敏感性的差异。　　方法：（1）建立以明胶/海藻酸钠/纤维蛋白原（GAF）为原料的水溶胶体系和以谷氨酰胺转胺酶（TGase）/氯化钙（CaCl2）/凝血酶（Thrombin）为交联剂的可生物打印的水凝胶材料体系；其中 TGase交联明胶，CaCl2交联海藻酸钠和 Thrombin交联纤维蛋白原；（2）使用清华大学生物制造中心研发的第三代生物打印机（TissFormⅢ），以上述水溶胶体系和GSCs（SU3）细胞悬液的混合体系作为生物墨水，利用低温成型原理生物制造具有多级孔结构的含细胞水凝胶网格支架结构；选择性使用不同交联剂的作用时机和时间，获得稳定的具有3D空间结构的含细胞多级孔水凝胶肿瘤模型；（3）对材料体系的空间结构进行大体形态、交联和降解的生物学特征评价；对3D生物打印GSCs模型进行体外研究，包括评估3D生物打印后的细胞活/死比例、增殖、显微镜下形态、电镜形态，不同时期病理形态、特征性标记物（Nestin, GFAP,β-tubulin III）及其他标志物表达的免疫组化；初步对比3D生物打印肿瘤模型和2D肿瘤模型在0、100、200、400、800、1600μg/ml替莫唑胺作用下的细胞活性。　　结果：（1）3D生物打印的生物材料水凝胶支架体系GAF可见多级孔结构，微孔尺寸在2-4μm；（2）体外3D生物打印胶质瘤干细胞建立了高活性可持续培养的3D脑肿瘤模型，体外培养21天仍然维持较高活性，细胞生长成簇团状；（3）3D生物打印胶质瘤干细胞在GAF水凝胶体系中仍然表达胶质瘤干/祖细胞标记物Nestin，可诱导分化表达GFAP和β-tubulinⅢ，证明胶质瘤干细胞在3D水凝胶GAF体系中不仅能够维持干性，而且保持了分化潜能；（4）TMZ药物敏感性研究发现在400-1600μg/ml的药物浓度内，3D生物打印胶质瘤模型比2D培养模型更加耐受化疗。　　结论：借助3D生物打印技术，结合水凝胶生物材料体系，本研究成功地在体外建立了可持续培养的高细胞活性的3D脑肿瘤模型，为体外研究胶质瘤干细胞微环境、化疗药物耐受和抗癌药物筛选提供了新的研究平台。　　第二部分：体外3D模型研究胶质瘤干细胞与间充质细胞融合　　目的：使用含细胞生物材料体外3D生物打印活体组织已经实现，但是由于水凝胶材料的存在导致部分细胞间的相互作用关系受到限制。本文报道一种多细胞异质脑肿瘤细胞线模型研究胶质瘤干细胞与骨髓间充质干细胞之间的相互作用关系。　　方法：自建同轴挤出3D生物打印系统，同轴挤出制造壳-芯结构，由海藻酸钠/明胶（A/G）材料包裹高密度细胞悬液的细胞线。其中A/G体系作为壳材料，人胶质瘤干细胞GSC23、人骨髓间充质干细胞（hMSCs）以及纤维蛋白原混悬溶液作为芯材料。为了观察肿瘤与间质相互作用关系，胶质瘤干细胞GSC23转染了包含“LOXP-STOP-LOXP-RFP”开关基因的慢病毒载体（GSC23-LOXP），人骨髓间充质干细胞（MSCs）转染了包含CRE酶开关基因的慢病毒载体（MSCs-CRE）。通过qPCR对比检测RFP转录水平和共聚焦显微镜观察RFP蛋白表达验证细胞融合现象。　　结果：同轴生物打印平台制造的胶质瘤干细胞与间充质干细胞组成的异质肿瘤细胞线产生细胞外基质主要成分胶原蛋白。利用CRE-LOXP开关基因系统，共培养7天后qPCR可见同轴细胞线中RFP转录水平高于对照组的2D模型和混合到水凝胶的混合组。GSC23-LOXP与MSCs-CRE发生了细胞融合，共聚焦观察到RFP的表达，而混合组则没有观察到明显的RFP表达。　　结论：同轴3D生物打印多细胞自组装异质肿瘤组织样细胞线为体外研究肿瘤微环境特别是肿瘤与间质相互作用关系提供了更优越的3D模型。胶质瘤干细胞和骨髓间充质干细胞在体外3D空间结构微环境中发生了细胞融合。　　第三部分：胶质瘤干细胞诱导间充质细胞恶性转化及机制的体内研究　　目的：建立荧光示踪的胶质瘤异种原位移植瘤，研究肿瘤微环境中胶质瘤干细胞与骨髓来源间充质干细胞相互作用关系。　　方法：（1）转染稳定表达RFP的胶质瘤干细胞SU3；（2）建立仅有骨髓来源细胞表达EGFP的荧光裸小鼠；（3）建立荧光示踪的原位异种移植瘤；（4）移植瘤原代培养分选宿主骨髓来源间充质干细胞（BMSC）并鉴定；（5）恶性转化BMSC体外特征、成骨成脂肪诱导和致瘤能力验证；（6）小RNA测序筛选差异表达miRNA；（7）过表达miRNA-146a-5p证实其功能；（8）miRNA-146a-5p的靶基因预测和验证；（9） siRNA干扰进行HNRNPD的功能验证。　　结果：（1）SU3RFP分别移植EGFP裸鼠和嵌合体裸鼠颅内建立得到原位异种移植瘤模型；（2）临床GBM标本移植EGFP裸鼠建立原位异种移植瘤模型；（3）移植瘤原代培养后分选得到3株表达EGFP的宿主来源细胞，分别命名为ihBTSC1、ihBTSC2和ihBTSC3；（4）三株细胞表达MSCs表面标记物并具有诱导成骨和成脂肪的潜能；（4）ihBTSC1和ihBTSC2具有显著的恶性特征，包括快速的增殖能力，侵袭能力和100%致瘤率；（5）小RNA测序筛筛选了19个上调miRNA和24个下调miRNA，（6） miRNA-146a-5p表达缺失参与到恶性表型，过表达后恶性表型下降；（7）双荧光素酶实验可见miR-146a-5p通过结合HNRNPD基因3‘UTR影响其荧光活性；（8）siRNA干扰HNRNPD表达抑制恶变细胞增殖和克隆形成率，而早期凋亡细胞比例增加。　　结论： miRNA-146a-5p表达缺失通过靶向调节HNRNPD参与了骨髓来源间充质细胞恶性转化及恶性表型的表达。