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血栓性疾病严重威胁人类健康。动脉血栓形成常导致相应脏器功能衰竭。研究血栓形成机制及探索抗血栓治疗方法是重要的研究方向。在动脉血栓形成中血小板发挥重要作用,血小板通过其表面膜糖蛋白(如GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ,GPⅡb-Ⅲa,GPⅥ,GPⅠa-Ⅱa)与损伤后暴露的血管内皮下胶原发生粘附,继而在损伤部位形成血小板凝块、促进凝血发生、导致血栓形成。由此可见,在血栓形成的起始阶段,血小板与胶原的有效粘附是不可缺少的先决条件,抑制血小板粘附功能将产生显著的抗血栓功效。新型抗血栓药物Abciximab阻断GPⅡb-Ⅲa与纤维蛋白原结合而发挥抗血栓作用,但也存在引起严重出血的潜在危险。近年来,抗粘附治疗作为新的抗血栓手段已引起广泛关注,通过抑制GPⅠb—vWF—胶原轴和GPⅥ/GPⅠa-Ⅱa—胶原轴阻断血小板与胶原的粘附,即在早期阶段阻止血小板的粘附、活化,可能起到更好的抗血栓形成作用,并可减少出血的危险性。在高剪切力条件下,血小板与胶原粘附依赖胶原受体GPⅥ、GPⅠa-Ⅱa,和间接胶原受体GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ。而血小板粘附后的活化过程主要由GPⅥ所介导。GPⅥ是血小板重要的胶原受体,生理状态下,GPⅥ与FcR γ链形成异源二聚体,共同发挥信号转导作用。GPⅥ基因剔除或抑制GPⅥ功能均可特异性地阻止血小板与胶原的粘附和聚集,对正常止血功能影响小。因而,GPⅥ成为抗粘附及抗血栓治疗的新靶点,GPⅥ功能抑制剂有望成为新的抗血栓药物。基于上述GPⅥ在血栓形成中的重要性,我们开展了GPⅥ功能研究及抗GPⅥ单克隆抗体的研制工作,以探索抗血栓治疗的新途径。采用基因重组技术克隆了GPⅥ胞外区基因片断,并在原核细胞中成功表达。以重组蛋白为抗原免疫小鼠,采用细胞融合和单克隆筛选技术制备了抗GPⅥ单克隆抗体;同时利用分子生物学技术克隆了该抗体的重链可变区和轻链可变区基因片断,经连接子连接后制备了单链抗体,并在原核细胞中表达。利用血小板聚集试验和流式小室技术观察了该单抗和单链抗体对胶原诱导的血小板聚集,以及对血小板与胶原表面粘附的抑制情况。一、以含GPⅥ全长cDNA质粒pBluescript KS(-)-GPⅥ为模板,采用PCR方法扩增GPⅥ胞外区片断cDNA序列,构建了表达载体pET-20b(+)-GPⅥ,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达目的蛋白。12%SDS-PAGE分析