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病毒病是农作物的主要病害之一，素有植物“癌症”之称，难以防治。将病毒基因组上基因的cDNA转化植物获取抗病毒工程植株是当前防治病毒病害的重要途径。但使用这种方法获得高抗转基因植物的几率较小，因而寻找一种更高效、经济的获取抗病毒转基因植株的方法已是当务之急，而RNA沉默机制的揭示为我们提供了新希望。本研究以在植物体内转录出RNA沉默的高效诱导因子-dsRNA为目标，将黄瓜花叶病毒部分复制酶基因和番茄花叶病毒移动蛋白基因以反向重复的方式与大豆内含子相连，并定向插入到植物表达载体pBIN438上35S启动子下游；在农杆菌介导的瞬时表达法预测所构建的重组载体对病毒侵染具有很强的干涉效应后，以农杆菌介导法转化烟草，分别获得了转黄瓜花叶病毒部分复制酶基因和番茄花叶病毒移动蛋白基因的转基因烟草，并对这两种转基因烟草植物进行了抗病性及抗性机制初探，具体结果如下： 1 黄瓜花叶病毒部分复制酶基因的反向重复植物表达载体构建 根据已报道的黄瓜花叶病毒(CMV)Fny分离物基因组的核苷酸序列设计特异性引物(在上游引物上引入SalⅠ酶切位点，在下游引物上引入ClaⅠ酶切位点)，以CMV Fny RNA2的全长cDNA克隆pFny209为模板，扩增出CMV的部分复制酶(△Rep)基因，将扩增的片段克隆到pUCm-T上获得重组克隆pUCm-△Rep，用PstⅠ和BamHⅠ酶从重组载体pUCm-△Rep上切下反向插入的△Rep基因，用△Rep基因中引入的SalⅠ位点和pUCm-T上的SalⅠ位点切下正向插入的△Rep基因。将反向△Rep基因定向插入含有正向大豆内含子(intron)的pBlue SK重组质粒(pSK-In)(由丹麦Johansen教授提供)上，接着用SalⅠ和BamHⅠ将包括Intron在内的片段切下，定向插入同样酶切开的pBIN438上，获得重组质粒pBIN-In-△Rep，随后将所得正向△Rep基因插入用SalⅠ切开且已去磷酸化的pBIN-In-△Rep上，获得了含反向重复CMV△Rep基因的植物双元重组表达载体pBIN-CMV△Rep(i/r)。 2 番花叶病毒移动蛋白基因的反向重复植物表达载体构建 根据已报道的番茄花叶病毒(ToMV)MP基因的核苷酸序列设计特异性引物(在上游 浙江大学博士学位论文 烟草抗病毒基固工程研究引物上引入 Bhl酶切位点），以 T。MV SI分离物的全基因组克隆（本实验室提供）为模板，扩增出 ToMV M基因，将扩增的片段分别克隆到 pGEM－T easy和 pUCm－1”上获得重组克隆 pGEM－W和 pUCm－M用 APal和 Sail酶从重组载体 pGEM－W上切下正向插入的ToMV N用 PStl和 foal从重组载体pUCm－N上切下反向插入的ToMV i将ApaI和 Sal酶切下的正向 MP基因定向插入同样酶切开的 pSK二n上，获得重组质粒pSK二，再将 Pstl和 Xbal从 pUCm1上切下的反向 MP基因定向插入同样酶切开的重组质粒 pSKJIMP上，获得含有反向重复 TOMV MP基因的重组质粒 pSK1OMV MP （i／r），随后用 BamH将含 Intron在内的 MP基因的反向重复片段切下，插入也用 Ban；HI切开且已去磷酸化的 pBpo438上，获得了含反向重复 TOMV M基因的植物双元重组表达载体叼IN－ToMV MP（i／r）。3植物双元重组表达载体转化农杆菌 用三亲交配法将含八R印门肋和 W门／r）基因植物双元表达载体幽tw－CMVARer 门／r）和 pBIN1OMV MPO／r）分别转入根癌农杆菌 EHA105菌株中，通过 PCR和酶切鉴定阳性的转化子用于非转基因烟草的瞬时表达或烟草的转化。4 目的基因的瞬时表达和对相关病毒的抗病性分析 用农杆菌浸润法在烟草的叶片组织中瞬时表达 CMVAR叩基因和 TOMV MP基因dSRNA，发现表达dSRNA的植物细胞可以阻止相关病毒的侵染，该方法的建立为快速预测重组载体的抗病毒效应提供了依据。5转基因烟草植株的获得 在农杆菌介导的瞬时表达法预测所构建的载体对病毒侵染具有很强的干涉效应后，；将含 CMVMopO／r）基因和 TOMV NO／r）基因的农杆菌与烟草叶盘共培养。经卡那霉素抗性筛选分别获得转 CMV凸Rop口／r）基因和 TOMV N一／r）基因的再生植株 40株和 47株，所有植株的 PCR检狈均为阳性；部分植株的 Southern印迹杂交表明 CMV＊R叩（i／r）基因和 T。MV N臼／r）基因已整合到烟草基因组中。但多次实验均未能检测出拷贝数，原因不详，进一步实验还在进行中。6转基因烟草植株的抗病性分析 用删V－PI、CMV－Fny和 CMV－RB的病汁液接种 40株伽V－FnyAR印（i／r）的转基因烟草，症状观察和 ELISA检测表明，同一转基因烟草植株对CMV分离物的抗性反应相似， 浙江大学博士学位论文 烟草抗病毒基因工程研究但不同转基因烟草植株对＊＊V的抗性强度不同。我们将其划分为三种抗病表现型：免疫型（植株在整个生育期未检测到病毒），抗病型（植株前期无病毒症状，后则有轻微症状，只能检测到少量病毒）和感病型（植株与对照发病相似，但稍轻）。其中，免疫型植株有15株，占转基因总株数的37％；抗病型植株有10株，占转基因总株数的25％；感病型植株有15株，占转基因总株数的37％。 用 TOMV的病汁液接种 47株 TOMV N（f）的转基