一氧化氮合酶(NOS)分三型,nNOS(神经源型),iNOS(诱生型)和eNOS(内皮型),其中nNOS和eNOS为钙调蛋白依赖型,主要存在于神经元细胞、内皮细胞、肾上腺皮质细胞和血小板中,钙调蛋白通过调控真核细胞内钙离子的浓度,从而直接调节nNOS和eNOS的活性。iNOS(诱生型)为非钙调蛋白依赖型,广泛存在于哺乳动物的细胞,不依赖于细胞内钙离子浓度来调节,但可被炎症所诱导,所有NOS都是二聚体,其中nNOS单个亚单元分子量是130-160kDa,而iNOS和eNOS则是130-135kDa。NOS通过氧化精氨酸产生内源性NO发挥生物学效应。NO具有亲酯性,可自由通过生物膜,半衰期只有3-5秒,是细胞内重要的信号分子。NOS三者之间介导生成的NO浓度存在明显差异,受多因素影响,导致其在不同组织中作用不尽相同。三种NOS亚型在癌细胞内定位及定量表达不同,调控产生的NO功能也不相同,一般来说,高浓度NO由iNOS介导生成,而低浓度NO往往由nNOS或eNOS产生。eNOS首先在血管内皮中被发现,在新生血管内皮细胞中则呈现强表达,因此,eNOS研究多集中在新生血管生成方面。eNOS主要定位于细胞浆,但在特定条件下,可表达于细胞核,与其他两种NOS亚型比较而言,eNOS呈最低表达。在脉管系统中,当细胞eNOS合成NO后,便活化sGC-cGMP信号途径,使血管平滑肌细胞松弛,调节血压。nNOS首先在神经组织中被发现,广泛分布于中枢神经系统和外周神经系统中,主要表达于细胞浆,参与神经肌肉接头信号传导等功能。iNOS主要由炎性信号(如细胞因子和内毒素)激活,对细胞内钙离子水平不敏感,故称之为诱导型NOS,如巨噬细胞中iNOS,受到炎症信号刺激后,持续产生高浓度NO,在杀伤细胞等功能中发挥重要作用。近来研究显示,三种NOS亚型在各种肿瘤组织中表达均普遍高于其相应的正常组织,肿瘤组织高表达NOS,能促进肿瘤发生、进展、淋巴结转移、远处转移和微血管浸润等。如nNOS在高分化肾透明细胞癌中表达下调甚至缺失,但在低分化肿瘤中则普遍高表达,而且nNOS表达强度越强,肿瘤恶性程度越高,此外,nNOS高表达还与微血管浸润、肿瘤转移相关,所以高表达的nNOS可能预示差的预后。另外,nNOS还与肿瘤免疫存在一定关联,一项对133例黑色素瘤免疫治疗研究发现,高表达nNOS能够抑制机体抗肿瘤免疫功能,下调黑色素瘤免疫治疗效果,揭示nNOS高表达能够抑制肿瘤免疫杀伤。不仅如此,nNOS高表达可能也参与了干细胞的增殖转化调控,能促使人类多潜能神经干细胞向肿瘤细胞迁移并转化,并能维持造血干细胞功能避免其耗竭,但是关于nNOS与结肠癌关系研究几乎无法查及,这也是本课题研究nNOS的价值所在。有研究,iNOS主要促进炎症相关肿瘤增殖,而nNOS/eNOS可能主要参与肿瘤与血管之间沟通的信号传导,协同调控肿瘤的浸润进展。eNOS能够促进内皮增殖和介导内皮生长刺激物(包括VEGF及PGE)的生成从而促肿瘤新生血管形成,进而促使肿瘤生长,另外活化的eNOS信号还能够增加血管的通透性,使得肿瘤的生长和迁移变得更加容易,所以介导微血管通透性改变也是eNOS促瘤作用的途径之一。但是eNOS促瘤作用并不仅仅局限于通过血管生成和通透性改变来实现,其还能够抑制TNF介导的肿瘤细胞凋亡从而加快肿瘤的浸润,另外,高表达eNOS与淋巴结转移,微淋巴管浸润,肾盂和输尿管浸润以及更低的总体生存率均存在相关,这些均提示eNOS的表达主要起促瘤作用,而靶向eNOS的抗肿瘤血管生成已成为肿瘤治疗研究的新方向。iNOS与肿瘤相关性的研究较多,大量文献显示,iNOS基因高表达能够促进胶质瘤、肺癌、胆管癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤生长和转移,其作用机制可能与iNOS相关的炎症因子相关。因此,抑制iNOS可能是干预一些炎症相关性肿瘤进展的重要措施,又由于iNOS的促炎症特征,iNOS调控肿瘤生长可能起双向作用。如在小鼠黑色素瘤和人肾癌细胞系中转染入iNOS基因将会导致肿瘤细胞致瘤性和转移能力抑制,又如iNOS的过表达在人肾癌细胞及鼠纤维肉瘤中能够弱化肿瘤的生长和迁移,均说明iNOS对肿瘤的作用受多种因素影响,如细胞微环境、细胞内氧化还原状态、以及细胞产生NO的浓度和持续时间等。NOS在肿瘤发生发展中具有重要作用,研究三种NOS亚型在肿瘤中的表达和调控作用,对阐明肿瘤发生发展和治疗具有重要意义。NO的肿瘤生物学效应主要取决于来源、浓度、一氧化氮合酶类型、组织反应性等方面。低浓度(pmol) NO常与sGC结合,导致细胞内cGMP分子水平增高,进而促进下游信号通路,如诱导VEGF表达介导新生血管形成使肿瘤细胞增殖、肿瘤生长,并可诱导上皮细胞DNA突变,进而促使肿瘤发生等。高浓度(300uM以上)NO具有抑制肿瘤作用,研究表明,在炎症条件下,iNOS产生高浓度NO阻止肿瘤细胞分裂周期,诱导细胞凋亡。抑制炎症相关的iNOS表达NO能力可抑制肿瘤血管增生,而诱导上皮细胞或巨噬细胞产生的NO可能靶向介导转移瘤细胞毒性,因此,NO既有促肿瘤作用,但在特定条件下又可能是一种保护因素,抑制肿瘤生长。结肠癌在我国发病率呈上升趋势,占各种肿瘤发病率的第三位。目前对结肠癌的治疗主要以手术为主,术后辅以联合放化疗、分子靶向治疗、中医药及免疫调节治疗等。虽然,结肠癌5年生存率在逐步提高,但是死亡率仍高居所有肿瘤第五位,阐明NOS与结肠癌发生发展的机制具有重要意义。结肠癌发生模型显示,结肠炎症与结肠癌的发生密切相关,炎症诱导抑癌基因APC、癌基因Ras突变,致结肠上皮细胞增生,进而P53基因突变,最终肿瘤形成并逐步演进,但是导致结肠癌的发生发展分子机制仍有待进一步阐明。人结肠上皮和结肠癌组织的免疫组织化学研究显示,与临近或正常对照结肠上皮组织比较,NOS在结肠癌中高表达。研究显示,iNOS在腺瘤和早期结肠癌组织中表达量最高,但随着肿瘤的分期变差而表达下降,究其原因,iNOS表达与结肠细胞恶性转化的关键基因——P53基因突变相关,认为iNOS与炎症相关因子共同参与了结肠上皮向肿瘤的转化过程,促进结肠癌的发生。但是iNOS在结肠癌形成后,随着肿瘤发展其表达量反而降低,还与结肠癌组织中T淋巴细胞的浸润相关,并且iNOS高表达的患者生存时间长,提示iNOS在后期可能通过炎症作用抑制结肠癌发展。大量研究显示,eNOS和nNOS在体内合成生理剂量的NO浓度,eNOS主要表达于肿瘤的血管内皮,特别是在肿瘤血管的内皮中高表达,诱导肿瘤新生血管形成而促进肿瘤生长。nNOS在结肠癌细胞中表达增强,但其在肿瘤发生发展中的作用研究较少,其机制尚不清楚。由于eNOS和nNOS持续合成生理剂量的NO,体外细胞学实验显示,低剂量NO促进肿瘤细胞增殖和迁移,诱导细胞抗凋亡功能。近年来,还有文献提示NO可作为肿瘤干细胞增殖的驱动因子,诱导干细胞增殖分化,因此,研究eNOS和nNOS在结肠癌中的的作用和机制具有重要意义。为探讨eNOS和nNOS在结肠癌中的表达及其分期和预后的相关性,我们通过生物信息技术,利用GEO公共资源数据库中结肠癌资料,分析了567例结肠癌转录组芯片数据,结果与文献报道一致,iNOS在结肠癌中的mRNA表达量随着结肠癌分期增加而降低,而且,与病人的生存时间呈正相关。但是,eNOS和nNOS的表达随着结肠癌分期增加而表达增强,而且,两者均与结肠癌患者生存时间呈负相关,提示eNOS和nNOS可能在结肠发展中发挥重要作用。又因为我们的前期实验显示,eNOS在结肠癌细胞中表达量极低,主要在肿瘤血管内皮中表达,因此,本研究分析了三种NOS亚型在结肠癌细胞株中定量及定位表达,并比较了它们在促结肠癌增殖及迁移中的作用,重点分析了nNOS在人结肠癌组织样本中的表达及其与临床分期、肿瘤分化和肿瘤转移等临床指标的相关性,探讨nNOS在结肠癌发展中的意义。实验目的：1.比较结肠癌细胞株中三种NOS亚型的表达和促肿瘤增殖和迁移作用,明确nNOS在促结肠癌增殖转移中所扮演的关键角色,并探讨NOS对结肠癌干细胞中的表达,以及其可能的调控作用；2.分析结肠癌临床样本中,nNOS表达与结肠癌临床分期和转移等临床指标的相关性,以及nNOS与病人生存时间的关系,探讨nNOS在结肠癌发生发展中的地位。统计学方法：我们使用SPSS 16.0统计学软件,检验水平以P<0.05或者P<0.01为差异有显著性,首先各组数据进行方差齐性检验,而后根据数据特征选择完全随机单因素方差分析、t检验和卡方检验,进行各实验组间表达情况的比较。实验结果：第一部分：NOSs在结肠癌细胞株中的表达和功能分析1. NOSs在结肠癌细胞株中表达：1) NOSs在结肠癌细胞株中定量表达比较：首先利用Western Blot技术,检测结果采用Quantity One分析软件,用条带轨迹定量分析法,对图片上的条带进行蛋白表达的相对灰度值测量,以GAPDH为内参,分别计算三种NOS蛋白的表达值,重复三遍,结果显示：nNOS表达最高,iNOS居中,eNOS最低,差异有统计学意义(RKO/LOVO/SW480/SW620中nNOS:0.59/0.69/0.62/0.32; iNOS: 0.20/0.09/0.29/0.23; eNOS:0.08/0.03/0.12/0.07;方差分析one-way ANOVA检验结果P<0.01)。利用流式细胞技术(FCM)对4株结肠癌细胞中三种NOS亚型的表达进行定量分析。收集培养细胞,制成单细胞悬液,用三种不同荧光偶联的抗体,分别标记三种NOS,以同型抗体IgG为阴性对照,流式细胞仪(FACS)分析。各样本分别收集三种NOS的荧光,每样本取10000个细胞的mean值(f1),以该样本的同型对照作为对照值(f2),各样本的NOS相对量为样本的荧光值减其对照值(F＝f1-f2)(重复三次)。结果与Western blot结果相似：四株结肠癌细胞株(RKO/LOVO/SW480/SW620)中,三种NOS亚型的表达量存在差异。其中nNOS表达最高,iNOS居中,eNOS最低,差异有统计学意义(RKO/LOVO/SW480/SW620中nNOS:489.7/239.9/350.7/366.4; iNOS: 250.6/44.75/42.6/76.9; eNOS:68.3/13.25/37.9/57.2;方差分析one-way ANOVA, P<0.01)。Real time PCR检测结肠癌细胞中NOS mRNA水平,我们同时还检测了6株结肠癌细胞(RKO, SW620, SW480, LoVo, HT29, M5)的mRNA水平。结果显示：三种NOS亚型在6株结肠癌细胞株中呈差异性表达。其中3株细胞(RKO, SW620, HT29)的eNOS mRNA水平较高,而另3种细胞(LoVo, SW480, M5)的iNOS mRNA水平较高,nNOS的mRNA水平与前面检测的蛋白水平不一致,均呈低水平状态。这些结果显示,在大肠癌细胞株中,NOS亚型的mRNA水平与蛋白水平不一致,可能其转录和蛋白质翻译水平存在差异。该实验显示：nNOS在结肠癌细胞株中蛋白质水平表达量高于iNOS和eNOS,提示nNOS可能在结肠癌细胞生物学功能中发挥作用。2) NOSs在结肠癌细胞中表达的定位分析：利用免疫荧光(IF),我们分析了三种NOS在4株结肠癌细胞中的表达情况。细胞株爬片培养后,荧光抗体标记三种NOS,倒置荧光显微镜下观察。结果显示：结肠癌细胞株中三种NOS均呈胞浆表达,nNOS主要位于胞浆表达,部分细胞核表达(15%),iNOS表达情况与nNOS相似,胞浆表达为主,部分核表达(12.6%),而eNOS仅在胞浆内表达,且表达量较低2 NOSs促结肠癌细胞增殖/迁移的作用：1) NOSs促结肠癌增殖作用：分别用三种实验方法：EDU增殖活性实验、CCK-8实验和平板单克隆实验检测结肠癌细胞的增殖功能。利用小分子化合物抑制NOS的功能,降低细胞内NO的浓度,探讨NOS亚型在结肠癌生物学功能中的作用。L-NAME为NOS非选择性抑制剂,可抑制三种NOS亚型的功能,N-PLA和1400W分别为nNOS和iNOS的特异性抑制剂。通过比较L-NAME、N-PLA和1400W对结肠癌细胞株增殖功能抑制程度,分析三种NOS亚型对四株结肠癌细胞株(RKO/LOVO/SW480/SW620)增殖的调控。EDU增殖活性实验结果显示：相对于PBS对照组,L-NAME、N-PLA和1400W组均显示结肠癌细胞增殖抑制(PBS对照：0.67005,1400W：0.57905,N-PLA:0.1761,L-NAME:0.10925),其中L-NAME与N-PLA组具有统计学差异(t-test,p<0.05)。L-NAME抑制作用最强,N-PLA次之。CCK-8实验：与PBS对照组相比,L-NAME. N-PLA和1400W组均显示结肠癌细胞增殖抑制(PBS对照：0.77,1400W:0.73, N-PLA:0.53, L-NAME: 0.48),其中L-NAME与N-PLA组具有统计学差异(t-test, P=0.0044 和0.0092)。 L-NAME抑制作用最强,N-PLA次之,1400W组最弱(t-test, P=0.1561)。平板单克隆实验：与PBS对照组相比,L-NAME. N-PLA和1400W组均显示抑制结肠癌细胞单克隆个数形成(PBS对照：29.3,1400W:23.9, N-PLA: 12, L-NAME:5.7)。其中L-NAME与N-PLA明显抑制(t-test, P=0.007和0.018),1400W轻微抑制(t-test, P=0.125),提示nNOS在影响结肠癌增殖功能方面可能所起作用最大。三组实验的结果显示,L-NAME抑制作用最强,N-PLA抑制作用次之,达L-NAME的88.8%,而1400W的抑制作用仅为L-NAME16.6%,提示三种NOS亚型均可能促进结肠癌增殖功能,nNOS在结肠癌增殖中起主要作用。2) NOSs促结肠癌迁移作用利用Transwell迁移实验和细胞划痕愈合实验,通过比较L-NAME、N-PLA和1400W对结肠癌细胞株迁移功能抑制程度,分析三种NOS亚型对四株结肠癌细胞株(RKO/LOVO/SW480/SW620)迁移的调控作用。Transwell实验结果显示：相对于PBS对照组,L-NAME、N-PLA和1400W组均显示结肠癌细胞迁移抑制(PBS对照：27.6,1400W：22,N-PLA: 7.6,L-NAME:5.3),其中L-NAME与N-PLA具有统计学差异(t-test、P=0.02和0.03)。L-NAME抑制作用最强, N-PLA次之,1400W轻微抑制(t-test, P=0.109)划痕愈合实验显示：6小时内对照组与实验组迁移率差别不大。6小时后开始出现差异,24小时后,相对于PBS对照组,L-NAME、N-PLA和1400W组均显示结肠癌细胞迁移抑制(软件分析划痕剩余面积：PBS对照：0.07,1400W: 0.16,N-PLA:0.65,L-NAME:0.73),其中L-NAME与N-PLA具有统计学差异(t-test,P=0.0006和0.002)。L-NAME抑制作用最强,N-PLA次之,1400W最弱。结果提示,非选择性抑制NOS(L-NAME组)或选择性抑制nNOS (N-PLA组)均可显著下调结肠癌细胞的迁移功能,而选择性抑制iNOS(1400W组)作用微弱,提示nNOS在结肠癌迁移调控中可能起到更为重要作用。2. NOSs调控结肠癌功能的机制为探讨nNOS调控结肠癌增殖和迁移功能的机制,我们通过westen blot技术,分析了L-NAME、N-PLA和1400W对肿瘤增殖和迁移重要的调控通路EGFR、wnt、AKT和c-jun-signal及其关键的下游靶分子C-myc和细胞周期调控蛋白Cyclin D1的调控作用。结果显示：与增殖和迁移功能实验抑制结果一致,L-NAME和N-PLA显著下调经EGFR, AKT磷酸化、wnt下游转录因子C-MYC和Cyclin D1的水平,但对c-jun调控作用轻微,提示nNOS可能通过影响EGFR和AKT以及wnt-signal等多条通路,参与结肠癌增殖和迁移的调控。1400w的抑制作用较弱,进一步支持nNOS为结肠癌主要的调控亚型。nNOS调控这些通路的具体靶点和机制有待进一步实验研究。第二部分：NOSs对结肠癌干细胞调控作用的分析1. NOSs在结肠癌干细胞与非干细胞中表达的比较：1) NOSs在结肠癌CD133+/CD133-细胞亚群中表达的比较：FACS分析：我们对4株结肠癌细胞株(RKO, LoVo, SW480, SW620),PE荧光抗体标记CD133+细胞,以区分该肿瘤干细胞的亚群。分别用不同荧光抗体标记nNOS, iNOS和eNOS (Daylight405,FITC,Alex647)。流式细胞技术(FCM)检测样本中CD133+干细胞/CD133-非干细胞亚群中,各三种NOS亚型的荧光值(nNOS-F, iNOS-F,和eNOS-F),比较它们之间的差异(荧光值为10000个细胞的平均荧光值),结果显示：nNOS、eNOS在CD133+结肠癌干细胞中表达显著高于在CD133-细胞表达,差别有统计学意义,而iNOS在CD133+与CD133-细胞中表达差别尚无统计学意义。Western blot分析：培养细胞制成单细胞悬液,荧光抗体标记CD133+抗原,流式细胞仪分选出CD133+和CD133-细胞各1×106,裂解后提取总蛋白,分别用Western blot检测其中三种NOS表达差异情况,结果显示：nNOS在CD133+细胞中表达大约是CD133-细胞中表达的2.5倍,而iNOS/eNOS表达弱且无明显差异,进一步说明nNOS与结肠癌干细胞可能存在相关。2) NOSs在结ALDH1+/ALDH1细胞亚群中表达的比较：接着用APC/CY7荧光标记ALDH1+细胞,以区分该肿瘤干细胞的亚群,不同荧光抗体标记nNOS, iNOS和eNOS (Daylight405,FITC,Alex647)。流式细胞技术(FCM)检测样本中ALDH1-干细胞/ALDH1-非干细胞亚群中,各三种NOS亚型的荧光值(nNOS-F,iNOS-F,和eNOS-F)差异,结果显示：nNOS在ALDH1+结肠癌干细胞中表达显著高于在ALDH1-细胞表达,差别有统计学意义,而eNOS.iNOS在ALDH1+与ALDH13-细胞中表达差别尚无统计学意义。2.NOSs促结肠癌干细胞功能的分析1)NOSs调控结肠癌王细胞比例：RKO细胞株分别经1400W,N-PLA及L-NAME处理后,制成单细胞悬液,PE荧光素螯合的CD133荧光抗体标记,流式细胞仪(FACS)检测细胞株中CD133+与CD133-细胞亚群的比例。以该同型抗体样本设定CD133+阳性细胞区域,并统计实验样本CD133+细胞的比例(每样本统计1x106个细胞,实验重复三次)。结果显示CD133+细胞的比例在各实验组为：1400W(1.73%±0.2%),N-PLA(0.83%±0.2%),L-NAME(0.4%±0.1%),与对照组(Control:3.73%±0.9%)相比,N-PLA和L-NAME能明显抑制CD133+细胞亚群的比例(p=0.027,和0.02),而1400W对CD133+细胞比例的抑制作用有限(p=0.082)。利用ALDH标志物,我们同样用FACS技术分析了NOS对ALDH+细胞亚群的调控,结果显示：ALDH1+细胞的比例在各实验组为：1400W(3.03%±1%),N-PLA (0.97%±0.1%),L-NAME(0.1%±0.01%),与对照组(Control:5.87%±1.5%)相比,N-PLA和L-NAME能明显抑制ALDH1+细胞亚群的比例(p=0.032,和0.022),而1400W对ALDH1+细胞比例的抑制作用有限(p=0.1293)。2)NOSs调控结肠癌王细胞增殖：利用扩增和富集肿瘤干细胞的悬浮培养技术(sphere formation),分析nNOS对结肠癌肿瘤悬浮细胞生长的影响,探讨NOS亚型对结肠癌干细胞增殖的调控。RKO细胞株用成球培养基重悬后计数,按照每个防粘附6孔板添加1000个细胞分配铺板悬浮培养成球,次日开始加入NOS抑制剂干预成瘤,设置对照组,定期添加抑制剂及更换培养液,14天后观察成球情况,测量长、宽并按照1/2×(长+宽)计算肿瘤球直径大小；结果显示：Control组直径最大(1238um),1400W次之(685 um),N-PLA与L-NAME基本相似且肿瘤球较少(分别是164um,188um)。3) NOSs对结肠癌王性因子表达的调控：转录因子Nanog、Sox2、Oct4在多种肿瘤干细胞中发挥重要的调控作用。我们利用NOS抑制剂(L-NAME及1400W, N-PLA)抑制结肠癌细胞株中NOS功能(总NOS及iNOS,nNOS), Western blot检测NOS抑制后肿瘤干细胞因子在蛋白表达水平的变化,探讨NOS对RKO结肠癌细胞株中肿瘤干细胞因子的调控作用。结果显示：RKO细胞株中Nanog和Sox2表达较强,Oct4表达较弱。总NOS抑制剂(L-NAME组)和特异性nNOS抑制剂(N-PLA组)能显著抑制Sox2表达,但对Nanog和Oct4抑制相对较弱。iNOS抑制剂(1400w组)仅对Sox2有微弱抑制作用。3. nNOS与结肠癌干细胞标志物CD133共表达的意义：nNOS在结肠癌干细胞(CD133+细胞和ALDH+细胞)中表达增强,而且增加结肠癌干细胞的比例,促进其增殖以及干细胞因子的表达。nNOS是否通过调控结肠癌干细胞表达和功能来调控干细胞增殖分化能力?nNOS与结肠癌干细胞标志物的共表达是否能更有效地标记结肠癌干细胞亚群,从而更有效地分离结肠癌干细胞?本课题将结肠癌细胞株悬液,用荧光抗体同时标记CD133、ALD、nNOS,FACS技术分析CD133或ALDH与nNOS的共表达关系。结果显示：nNOS与CD133或ALDH双标记后,将结肠癌细胞株分成高表达和低表达的两细胞亚群(CD133+/nNOS+与CD133-/nNOS-群；或ALDH+nNOS+群与ALDH-nNOS-).结肠癌细胞株中,nNOS与CD133或ALDH1双标记的亚群(CD133+/nNOS+,ALDH+nNOS+)占结肠癌细胞的20%-30%,较CD133+或ALDH1单标记结肠癌干细胞亚群(1-3%)比例增加,而且分群明显。该亚群细胞不仅干细胞标志物(CD133、ALDH)高表达,而且具备nNOS相关的促结肠癌干细胞增殖和迁移功能,因此,CD133+/nNOS+或ALDH+nNOS+双阳性细胞亚群,可能更好地划分了结肠癌中的干细胞亚群,靶向这些结肠癌细胞,可能成为结肠癌治疗的新策略。第三部分：nNOS在结肠癌临床样本中的分析1. nNOS在结肠癌组织标本中表达与临床相关因素的关系分析收集27例结肠癌临床样本进行免疫组化分析,免疫组化检测结果评定标准参照如下文献(Li J,et al. Clin Cancer Res.2008; 14; 6996-7003. Luo W, Int J Cancer.2012;131:1863-73),采用阳性细胞面积以及染色强度进行综合评分。阳性细胞等级评分如下：细胞数阴性为0分,1%-9%为1分,10%-50%为2分,51%-100%为3分；染色强度按细胞着色评分如下：不着色为0分,淡黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分。最后两项得分相乘,0分-4分为低表达,(6分-9分)为高表达。1) NOSs在结肠癌组织样本中表达分析：27例结肠癌临床样本,从中挑出10例能清楚显示结肠癌及癌旁组织样本,利用免疫荧光、免疫组织化学技术,分析比较三种NOS亚型在结肠癌组织样本中的表达和定位情况。结果显示：与细胞株表达类似,NOS主要位于胞浆内表达,nNOS/iNOS部分可见核表达；且nNOS表达最强,iNOS次之,eNOS呈微弱表达。2)结肠癌细胞与癌旁肠上皮中(癌旁组织)nNOS表达的比较：接着比较了nNOS在癌与癌旁组织中表达量的区别,结果显示：结肠癌组织有6例nNOS高表达(6/10),而癌旁组织中仅有1例呈nNOS高表达(1/10),提示nNOS在结肠癌组织中表达明显强于癌旁组织,统计学分析差别显著。2. nNOS表达与27例结肠癌病人的临床资料分析1) nNOS表达与病人的临床分期和分化程度相关：27例结肠癌组织按细胞分化程度分为高分化与低分化两组,低分化组nNOS强表达者多于高分化组,两两比较差别显著(73.3%与8%,卡方检验P=0.0014)；按T分期,将样本分为T1-2早期组和T3-4晚期组,晚期组中nNOS强表达者多于早期组,两两比较差别显著(75%与20%,卡方检验P＝0.0071)；按Dukes’分期,将样本分为Ⅰ-Ⅱ早期组和Ⅲ-Ⅳ晚期组。晚期组中nNOS强表达者多于早期组,两两比较差别显著(81.8%与18.75%,卡方检验P=0.002)。2) nNOS表达与结肠癌并发远处转移相关分析：按是否发生淋巴结远处转移分期,将样本分为NO-1早期组和N3-4晚期组。晚期组中nNOS强表达者多于早期组,(75%与31.6%,卡方检验P=0.087)；按肿瘤是否发生远处转移分期,nNOS强表达者在M1分期多于M0分期(71.4%与35%,卡方检验P=0.185)。但同类两两比较差别尚不显著,nNOS是否促进结肠癌转移尚需后期加大临床样本验证。3) nNOS表达与性别和年龄无相关性：(男：35.3%,女：60%,卡方检验P=0.2566；<45岁组：41.2%,≥45岁组：40%,卡方检验P=I)。3. nNOS表达与567例结肠癌(GSE39582)预后的分析1) nNOS表达与结肠癌分期关系：利用GEO公共资源库567例结肠癌转录组芯片数据和临床资料,我们分析了NOS三种亚型与结肠癌分期／病人生存时间的相关性,探讨NOS各亚型在结肠癌发生发展中的作用。将567例结肠癌按Dukes’分期分为一、二、三、四期(1,2,3,4期),分析各期病人的nNOS、iNOS和eNOS的表达量与疾病分期的关系。结果显示：分期越差,nNOS表达越高,iNOS表达越低：eNOS在1,2期随着结肠癌的发展而升高,但在结肠癌3、4期则下降,提示nNOS和iNOS可能在结肠癌发生过程发挥作用但相反。另外,在4例结肠癌原位癌中,nNOS和iNOS的表达较高,而eNOS则表达较低,提示nNOS和iNOS在原位癌中呈高表达。2) nNOS表达与结肠癌生存时间关系：将567例病人芯片数据中显示的nNOS、iNOS和eNOS各自的mRNA相对表达量,以表达均数为分界线,分成高表达与低表达两组(nNOS-High与nNOS-Low; iNOS-High与iNOS-Low; eNOS-High与eNOS-Low)。分别分析nNOS、iNOS和eNOS表达与结肠癌病人生存时间(初次确诊至死亡的时间)的相关性。结果与前面的分期分析相似：nNOS和eNOS均与结肠癌病人的生存时间呈负相关(p=0.01和p=0.03),而iNOS的表达与病人的生存时间呈正相关(p=0.05)。3) NOSs表达与结肠癌关键调控因子的相关性：我们接着分析567例结肠癌病人NOS表达与抑癌基因APC、PTEN表达的关系,以及与c-myc、SOX2等干细胞转录因子相关性。结果显示：nNOS/eNOS均与APC/PTEN呈负相关,与SOX2、c-myc呈正相关,提示nNOS和eNOS可能通过下调APC和PTEN而分别激活Wnt和AKT通路,促进结肠癌增殖转移,iNOS的表达与以上调控因子和转录因子无相关性。这些公共资源库的独立资料分析支持我们的实验结果。结论：1.三种NOS亚型在结肠癌细胞株中呈差异性表达,且都促进结肠癌增殖和迁移功能,其中,nNOS表达量最高,且作用最强。2. nNOS高表达于结肠癌细胞株中干细胞亚群,能提高结肠癌干细胞比例,促进增殖和干细胞相关因子的表达；nNOS与结肠癌干细胞标记物CD133或ALDH1共表达,可能比单标记更好地划分结肠癌干细胞,靶向这群细胞,可能是结肠癌治疗的新策略。3.人结肠癌组织样本中,免疫组织化学显示结肠癌组织nNOS表达明显高于癌旁组织,芯片数据显示nNOS表达强度随结肠癌分期增加而增强。nNOS表达与结肠癌临床分期呈正相关,且细胞分化越差nNOS表达越高,而且,nNOS与结肠癌转移可能存在相关,与年龄和性别无相关性。567例芯片数据分析显不,nNOS高表达与结肠癌生存呈负相关,提示nNOS可能在结肠癌发生发展中发挥重要作用。4. nNOS表达与wnnt和AKT通路的关键负调控因子APC和PTEN呈负相关,调控EGFR,AKT磷酸化,以及其下游的关键转录因子C-MYC和Cyclin D1的表达,对beta-catenin表达无显著改变,提示1iNOS可能主要通过AKT通路促进结肠癌增殖、迁移以及干细胞功能,进一步阐明nNOS调控靶点,可能为结肠癌治疗提供新的治疗策略。