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胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶(Thymidine Phosphorylase,TP)是一种核苷磷酸化酶,它在微生物和真核生物体内普遍存在,在核苷酸代谢过程尤其是补救合成途径中发挥重要作用,通过转糖苷作用可催化生成多种核苷类化合物。但目前工业中用来制备核苷类化合物的方法主要是化学法,化学法的反应条件要求高,步骤较繁琐且污染环境。而近年来兴起的酵母表面展示技术可以集酶的表达、纯化和固定于一体的,催化效率高,是一种可重复利用且处理工艺简单的催化平台。本文分别基于两种不同的锚定系统,构建了TP的毕赤酵母和酿酒酵母表面展示系统,探索了将其作为全细胞催化剂制备核苷类化合物的可能性。本文从大肠杆菌K12菌株中克隆编码TP的deo A基因,利用酵母表达质粒p KFS构建了重组质粒p KFS-LA,电击转入GS115细胞,构建了毕赤酵母的重组转化子。高拷贝阳性转化子经甲醇诱导96 h后,免疫荧光结果显示TP在酵母细胞表面成功展示。利用30 m M的!-胸苷为底物,重组酵母细胞作为全细胞催化剂,在50℃下反应2 h。经HPLC检测结果表明展示在酵母表面的TP具有催化活性,可以催化!-胸苷生成产物胸腺嘧啶,转化率为7.5%。另外,本论文同时利用酵母表达质粒p YD1构建了重组质粒p YD1-deo A,利用PEG1000化学转化酿酒酵母EBY100菌株,构建了酿酒酵母转化子。阳性转化子经半乳糖诱导48 h后,进行免疫荧光检测,结果表明TP成功表达在酿酒酵母表面;在50℃下以酿酒酵母转化子为全细胞催化剂反应2 h,对30 m M!-胸苷的催化活性经HPLC检测为10.87%。利用酿酒酵母转化子为催化剂,通过对其他核苷类化合物如5-氮杂胞苷的催化反应检测,发现TP具有较高的底物特异性,可以催化尿嘧啶核苷类化合物,但无法催化胞嘧啶核苷类化合物的转糖苷反应。本论文利用酵母表面展示技术,成功构建了胸苷磷酸化酶的毕赤酵母转化子和酿酒酵母转化子,且均具有催化活性。本课题为利用生物酶法合成核苷类化合物及相关研究奠定了基础。