马铃薯病毒性病害是导致马铃薯产量下降,品质变劣的主要原因之一,可导致马铃薯的利用价值大大降低,已给世界和我国造成了严重的损失。目前,利用RNAi(RNA inference,RNAi)技术进行的抗病毒基因工程是抗马铃薯病毒的有效手段之一。RNAi是生物体(植物、动物和真菌等)中一种同源性依赖降解特定mRNA的保护机制。RNA介导的抗病毒最有效的策略是通过构建病毒特定基因片段反向重复序列载体转入植物中,转录后生成PNA发夹结构(hairpin-RNA,hpRNA),发夹结构的柄可诱导转录后沉默过程(Post-Transcriptional Gene Silencing,PTGS)过程,实现抗病毒目的。因此,构建hpRNA高效表达载体对成功利用RNAi技术培育抗病毒转基因作物起着至关重要的作用。本研究主要包括两个部分内容,介绍如下:第一部分为贵州不同地区马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)外壳蛋白(coatprotein,CP)基因的克隆及遗传分析,这是马铃薯抗病毒基因工程重要的前期工作。从中国贵州不同地区采集感染马铃薯Y病毒(PVY)病害叶片,利用试管捕捉RT-PCR(the tube capture RT-PCR,TC-RT-PCR)方法克隆到长度为804bp的8个目的片段,序列分析表明为PVY外壳蛋白(PVY-CP)基因。通过与已经发表的PVY-CP基因序列进行比较和遗传分析,得出如下结论:1)通过CP基因进行序列分析,可以明确的将PVY三个株系区分开来,说明利用CP基因去分类PVY是可靠的。2)通过系统树将本研究分离的PVY,7株鉴定为O株系,1株鉴定为NTN株系,并说明PVY~O可能是贵州地区普遍存在的PVY类群。3)对已报道的PVY~O和PVY~N进行同源性比对,发现两个株系间有较大的序列差异,并发现5‘端差异非常明显,3’端比较保守。同源性分析给予RNAi抗病毒基因工程的靶基因片段的选择一定的指导性,是重要的前期工作。第二部分主要是探索PVY-CP基因片段的同源性、位置和大小因素对抗病性影响。根据PVY不同株系CP基因同源性差异,设计了不同大小片段干涉载体,通过瞬时表达分析探索这些载体的抗病毒效率,得出如下结论:1)用于研究同源性的干涉载体pH-Y100-390、pH-Y246-508和pH-Y23-260,研究位置影响的干涉载体pH-Y451-750和pH-Y246-508都获得较高的抗病性,差异不明显。2)通过对选择片段大小不同的载体pH-Y246-508、pH-Y330-528、pH-Y386-528和pH-Y404-507的抗病性的研究,发现选择片段为104bp的载体pH-Y404-507出现抗病性明显降低的现象,而其他三个载体都获得了100%抗病率。因此,本研究初步将将能引起高效抗性的最短片段定位到104-143bp之间,这为进一步的研究多抗转基因研究奠定了一定的理论基础。3)通过以pHellsgate12和pROKII为基础构建的PVY干涉载体pH-Y451-750和pR-Y451-750抗病性的比较,说明含有内含子的pHellsgate12载体是高效的,可以广泛应用到马铃薯抗病毒研究中。